單片段典型實驗案例分析
來自同濟大學A課題組
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實驗要點
實驗思路設計完整。
載體線性化完全，載體、片段均純化。
載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應時間50℃，10 min。（小翌家的10923ES單片段連接也可快至5 min，歡迎嘗試~）
實驗嚴謹且驗證充分，菌P、測序均驗證。
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實驗亮點
在10 μL小體系下，通過10923ES克隆試劑盒成功構建了單基因過表達載體，陽性率可達100%。
多片段典型實驗案例分析
來自同濟大學B課題組
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實驗要點
實驗思路設計完整。
載體線性化完全，載體、片段均純化。
載體/片段摩爾比為該實驗者經驗累計，由1：2調整為1：1和1：3。小翌依舊推薦載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應時間50℃，30 min。（此為4片段連接標準時間，小翌嚴選推薦！）
實驗嚴謹且驗證充分，菌P、測序均驗證。
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實驗亮點
4片段+載體連接成功，克隆數優于競品，陽性率100%。片段中包含高GC序列、3×flag標簽，片段投入量小于50ng，連接難度較大。
看了以上兩位同學的實驗結果，你是否也心癢難耐，想要一展身手！
要想獲得成功的實驗結果，嚴謹的實驗設計思路和適合的實驗方法是重中之重。小翌強烈推薦Hieff Clone®系列克隆試劑盒（Cat#10923ES），為您的實驗保駕護航！那么實驗記錄表也是必不可少的，既可以幫助大家記錄實驗細節，也能通過記錄表復盤實驗思路，事半功倍！小翌根據自己做實驗的經驗總結了實驗記錄本格式，放于文章最后，小伙伴們可自行取用~
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載體大小 |
bp |
片段大小1、2、3... |
bp |
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載體酶切位點 |
（如果為反向PCR，可不填） |
片段含同源臂的引物序列 |
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可通過翌圣無縫克隆引物設計軟件（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）進行引物設計 |
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線性化載體純化方式 |
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片段純化方式 |
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載體濃度 |
ng/μL |
片段濃度 |
ng/μL |
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載體投入體積 |
μL |
片段投入體積 |
μL |
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推薦翌圣官網—支持中心—生物計算器—克隆連接投入量計算板塊，輸入片段數、濃度、大小，即可獲得投入量：https://www.yeasen.com/calculator.html#/cloning-link/ |
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反應條件 |
溫度 ℃、時間 min |
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感受態轉化步驟 |
如：小翌的快速感受態細胞 1、提前15 min將LB平板放到37℃培養基中預熱。 2、將F-DH5α感受態細胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）從-80℃拿出迅速插入冰上，待菌體融化，加入目的DNA（質?；蜻B接產物），輕輕彈勻，冰浴靜置5 min。 3、用200 μL移液槍將上一步的混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養基上，均勻涂布。 4、將平板置于37℃培養箱倒置過夜培養。若進行藍白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養15 h。 |
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挑單菌落 |
用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混勻（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進行PCR反應。共計挑 個單菌落，陽性率 （陽性條帶數/單菌落個數）。 |
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測序 |
（推薦使用一條載體通用測序引物+目的片段另一端引物送去測序驗證） |
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明星產品推薦
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克隆實驗流程 |
產品定位 |
名稱 |
貨號 |
規格 |
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載體、片段制備 |
高保真PCR |
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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同源重組 |
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應 |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
20 T/50 T |
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轉化 |
5 min快速完成感受態轉化 |
F DH5α化學感受態 |
10×100 μL |
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菌落PCR |
快速PCR升級，可菌P且適用復雜模板擴增 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix |
1 mL/5×1 mL |
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目的片段保存、測序 |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 |
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |