單片段典型實(shí)驗(yàn)案例分析
來(lái)自同濟(jì)大學(xué)A課題組
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實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)完整。
載體線(xiàn)性化完全，載體、片段均純化。
載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時(shí)間50℃，10 min。（小翌家的10923ES單片段連接也可快至5 min，歡迎嘗試~）
實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)且驗(yàn)證充分，菌P、測(cè)序均驗(yàn)證。
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實(shí)驗(yàn)亮點(diǎn)
在10 μL小體系下，通過(guò)10923ES克隆試劑盒成功構(gòu)建了單基因過(guò)表達(dá)載體，陽(yáng)性率可達(dá)100%。
多片段典型實(shí)驗(yàn)案例分析
來(lái)自同濟(jì)大學(xué)B課題組
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實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)
實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)完整。
載體線(xiàn)性化完全，載體、片段均純化。
載體/片段摩爾比為該實(shí)驗(yàn)者經(jīng)驗(yàn)累計(jì)，由1：2調(diào)整為1：1和1：3。小翌依舊推薦載體：片段的摩爾比1：2。
連接反應(yīng)時(shí)間50℃，30 min。（此為4片段連接標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間，小翌嚴(yán)選推薦！）
實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)且驗(yàn)證充分，菌P、測(cè)序均驗(yàn)證。
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實(shí)驗(yàn)亮點(diǎn)
4片段+載體連接成功，克隆數(shù)優(yōu)于競(jìng)品，陽(yáng)性率100%。片段中包含高GC序列、3×flag標(biāo)簽，片段投入量小于50ng，連接難度較大。
看了以上兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，你是否也心癢難耐，想要一展身手！
要想獲得成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路和適合的實(shí)驗(yàn)方法是重中之重。小翌強(qiáng)烈推薦Hieff Clone®系列克隆試劑盒（Cat#10923ES），為您的實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！那么實(shí)驗(yàn)記錄表也是必不可少的，既可以幫助大家記錄實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，也能通過(guò)記錄表復(fù)盤(pán)實(shí)驗(yàn)思路，事半功倍！小翌根據(jù)自己做實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)了實(shí)驗(yàn)記錄本格式，放于文章最后，小伙伴們可自行取用~
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載體大小 |
bp |
片段大小1、2、3... |
bp |
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載體酶切位點(diǎn) |
（如果為反向PCR，可不填） |
片段含同源臂的引物序列 |
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可通過(guò)翌圣無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件（https://www.yeasen.com/hieff-clone/）進(jìn)行引物設(shè)計(jì) |
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線(xiàn)性化載體純化方式 |
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片段純化方式 |
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載體濃度 |
ng/μL |
片段濃度 |
ng/μL |
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載體投入體積 |
μL |
片段投入體積 |
μL |
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推薦翌圣官網(wǎng)—支持中心—生物計(jì)算器—克隆連接投入量計(jì)算板塊，輸入片段數(shù)、濃度、大小，即可獲得投入量：https://www.yeasen.com/calculator.html#/cloning-link/ |
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反應(yīng)條件 |
溫度 ℃、時(shí)間 min |
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感受態(tài)轉(zhuǎn)化步驟 |
如：小翌的快速感受態(tài)細(xì)胞 1、提前15 min將LB平板放到37℃培養(yǎng)基中預(yù)熱。 2、將F-DH5α感受態(tài)細(xì)胞（DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）從-80℃拿出迅速插入冰上，待菌體融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物），輕輕彈勻，冰浴靜置5 min。 3、用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布。 4、將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。若進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h。 |
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挑單菌落 |
用無(wú)菌的槍頭或牙簽將單個(gè)菌落挑至新一代快速菌落PCR Mix中混勻（2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix，Cat#10167ES），加入引物直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。共計(jì)挑 個(gè)單菌落，陽(yáng)性率 （陽(yáng)性條帶數(shù)/單菌落個(gè)數(shù)）。 |
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測(cè)序 |
（推薦使用一條載體通用測(cè)序引物+目的片段另一端引物送去測(cè)序驗(yàn)證） |
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明星產(chǎn)品推薦
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克隆實(shí)驗(yàn)流程 |
產(chǎn)品定位 |
名稱(chēng) |
貨號(hào) |
規(guī)格 |
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載體、片段制備 |
高保真PCR |
2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye) |
1 mL/5×1 mL |
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同源重組 |
1-7片段一步法定向連接，最快5分鐘完成重組反應(yīng) |
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit |
20 T/50 T |
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轉(zhuǎn)化 |
5 min快速完成感受態(tài)轉(zhuǎn)化 |
F DH5α化學(xué)感受態(tài) |
10×100 μL |
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菌落PCR |
快速PCR升級(jí)，可菌P且適用復(fù)雜模板擴(kuò)增 |
2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix |
1 mL/5×1 mL |
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目的片段保存、測(cè)序 |
TOPO克隆-兼容TA/平末端 |
Hieff Clone® Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit |
20 T |