經常會有小伙伴問用CRISPR/Cas9系統敲除整個外顯子或者lncRNA的效率是多少，和敲除片段的大小有關系嗎？為了回答這個問題，在此和大家分享一篇驗證這類敲除效率的文章。
文章題為“Characterization of Genomic Deletion Efficiency Mediated by Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 Nuclease System in Mammalian Cells”，2014年發表在JBC上，NCBI顯示目前已經累計被引用154次。
為了研究CRISPR/Cas9介導的基因組片段敲除的效率，該文章設計了一系列的成對sgRNA用于敲除長度在1.3kb到1MB的基因組上的片段（圖1）。這些片段有些位于外顯子區，有些位于內含子區，也有部分位于基因間區。且涉及被編輯的基因都與細胞增殖無關。
圖1. 成對sgRNA靶點設計
成對sgRNA設計，雖然有可能會將兩個sgRNA中間片段敲除，但也可能在原位修復，不發生刪除。為了檢測出現的具體結果，在不同的靶點附近，作者設計了多對引物。
圖2. 修復結果分析的引物設計
在開始檢測該細胞是否有等位基因發生敲除時，利用了圖2中上面的藍色及紅色兩對引物，紅色引物位于兩個sgRNA之間，藍色引物位于兩個sgRNA之外。此時有三種情況，第一，如果紅色引物PCR后跑DNA膠無條帶，藍色引物PCR有條帶（如果中間片段沒有被敲除，藍色引物中間片段過長，PCR無法擴增出該產物），則說明是純合子敲除。第二，如果紅色引物PCR有條帶，而藍色引物PCR也有條帶，則說明雜合子敲除。第三，如果紅色引物PCR有條帶，而藍色引物PCR無條帶，則說明沒有發生敲除。
但是，對于紅色引物PCR產物有條帶，還有一種情況需要分析，即兩個sgRNA中間片段是否發生了顛倒。于是作者又設計了圖2中下面的綠色及紫色兩對引物用于擴增sgRNA靶點及其附近序列，如果引物1,2和引物3,4分別PCR有條帶則說明沒有發生顛倒，如果引物1,3和引物2,4有條帶則說明中間片段發生了顛倒。
圖3. 成對sgRNA切除基因片段效率
17對sgRNA挑選出了1974個克隆，最終共檢測了278個單克隆細胞株。按照等位基因進行分析，278株細胞有556個等位基因。149/556(26.8%)個等位基因中間片段被刪除，72/556(12.9%)個等位基因中間片段發生了顛倒，剩余約60%在Cas9切割的位置原位修復，未導致刪除。在做外顯子敲除時，等位基因顛倒的情況也是可以考慮的一種基因編輯方式。從整體看，等位基因顛倒加上刪除的比例接近40%。但是，對于lncRNA的敲除，由于不確定顛倒是否會失活其功能，因此lncRNA不建議使用顛倒的克隆用于后續實驗。
按照細胞株進行分析，31/278(11.2%)的細胞為雙等位基因刪除細胞，2/278(0.7%)的細胞為雙等位基因顛倒細胞。26/278(9.4%)的細胞其中一個等位基因刪除，一個等位基因顛倒。61/278(21.9%)的細胞其中一個等位基因敲除，另外一個等位基因在Cas9切割的位置原位修復。39/278(14.1%)的細胞其中一個等位基因顛倒，另外一個等位基因在Cas9切割的位置原位修復，而兩個等位基因既沒有刪除又沒有顛倒的細胞比例為119/278(42.8%)（圖3）。
在將所有數據統合后，文章進一步分析了敲除片段長度與敲除效率的關系（按照等位基因進行分析），得出結論，敲除效率與敲除長度呈負相關性（圖4）。可以看到，當敲除片段在23kb以內時，敲除效率基本都在10%以上，甚至還有許多片段的敲除效率在20%乃至30%以上。
圖4. CRISPR-cas9介導的基因組片段敲除效率
與片段大小呈現負相關性
除去這些敲除效率的信息外，文章中還有一些值得留意的細節。第一，6/40(15%)雙等位基因敲除細胞是精確刪除的；27/87(31%)的單等位基因敲除細胞是精確敲除的。補充一下，目前認為野生spCas9的切割位點位于靶點的第17和18位中間，切割產生平末端，所謂精確敲除即兩個cas9切割后的序列直接相連，中間沒有缺失或者插入其他序列。第二，對于不是精確刪除的細胞，由于兩個平末端是被NHEJ修復方式修復的，往往會引入一些indel，這些indel的長度絕大部分集中在-10bp-0bp（負號代表刪除，正號代表插入）。第三，對于雙等位基因敲除細胞，其中部分進行一代測序發現，22/31(71%)的細胞兩個等位基因中間的indel序列是完全相同的，9/31(29%)的細胞兩個等位基因的indel片段不同。
如果將這里的第一點和第三點結合起來看，會發現NHEJ比較有趣的一些內容。比如，如此高的精確修復比例，說明NHEJ修復過程中有很大可能是不引入indel的。再比如，高比例的純合子刪除（indel相同）暗示NHEJ可能存在按照模板修復的可能性。
對于刪除超過1MB（1000kb）的片段，即在染色體層面刪除基因組的大片段，這篇文章篩選的比例為4/339，略微超過1%。還有其他一些文章篩選后給出的比例基本都是1%。如此低的比例如果去篩選單克隆細胞株的話，是一個非常大的工作。并且，1%并不意味著100個細胞一定能篩到一個，被各種游戲廠商騙去抽過卡的同學可能更能理解什么叫非酋。因此，這里給大家介紹一個方法，可以在有限稀釋的時候按照每孔5-10個細胞進行稀釋，用流式細胞儀種細胞也按照每孔5-10個細胞進行接種。在這些孔中我們檢測到有陽性細胞后，再用該孔細胞挑一次單克隆即可，第二次挑單克隆的陽性比例將直接上升到10%-20%。兩種情況下，我們推薦采用上面介紹的方法：第一，敲除片段在1000kb以上；第二，敲除片段在1000kb以下，PCR驗證有陽性細胞，但是單克隆挑選非常多次依然未篩選到陽性克隆。
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