自噬-溶酶體途徑是真核生物細胞內用來抵抗病原菌，清除變性蛋白和異常細胞器的主要機制之一。自噬-溶酶體途徑的異常和包括帕金森癥、阿茲海默癥在內的多種神經退行性疾病以及癌癥密切相關。TFEB 是非常重要的轉錄因子，調控自噬相關基因的表達，在自噬通路中發揮重要作用和功能，但具體作用機制目前尚不清楚。
2019年1月21日中國科學院生物物理研究所在《Autophagy》（IF：11.059）上在線發表了題為“YWHA/14-3-3 proteins recognize phosphorylated TFEB by a noncanonical mode for controlling TFEB cytoplasmic localization” 的文章揭示了YWHA/14-3-3與轉錄因子TFEB結合并調控TFEB亞細胞定位和轉錄活性的機制。
該研究中作者通過結構生物學與生化手段，解析了YWHA/14-3-3與TFEB-p-S211復合物的結構，利用結構信息發現YWHA/14-3-3與TFEB-p-S211以一種新的非典型模式結合。
通過進一步對蛋白與小肽相互作用界面上的關鍵氨基酸進行突變并結合細胞定位實驗，提出了潛在的YWHA/14-3-3 蛋白調節 TFEB 的入核機制。這對于以 TFEB為靶點的新的治療方案的研究有指導作用。
作者首先對YWHA/14-3-3和TFEB兩個蛋白進行二級結構預測以及結構域分析，結合已有的報道分析出磷酸化的TFEB中S142和S211兩個位點與調控TFEB的亞細胞定位有關（圖1. A,B）。
由吉凱基因構建TFEB及其關鍵位點突變體的質粒，通過免疫共沉淀實驗（圖1. C）分別驗證野生型TFEB 以及突變體與YWHA/14-3-3 蛋白兩種亞型的相互作用關系。通過ITC實驗（圖1. D）比較它們之間的結合力大小，進一步證明了只有磷酸化的TFEB中S211位點與YWHA/14-3-3 蛋白存在相互作用。
圖1. 磷酸化的TFEB中S211位點與YWHA/14-3-3 蛋白存在相互作用
作者分別解析了YWHA/14-3-3蛋白的兩種亞型YWHAB和YWHAG分別與TFEB-p-S211形成復合物的結構。在復合物結構中整體結構為二聚體，在每個單體均由9個反向平行的 α 螺旋（αA-αI）構成。αA-αD形成馬蹄鐵狀結構域，并且二聚體的兩個亞基是雙面對稱的（圖2. A-C）。
二聚體的每個亞基中，αC，αE，αG 和 αI 構成一個兩親性的底物結合溝槽（活性中心），并特異性結合TFEB-p-S211 磷酸化小肽（圖2. D,E）。
圖2. YWHA/14-3-3蛋白的兩種亞型分別與TFEB-p-S211復合物的整體結構圖
作者選取了YWHAB 和 TFEB-p-S211復合物的結構進行后續詳細的結構分析。YWHAB 和 TFEB-p-S211的結合主要是通過疏水作用力，靜電相互作用以及氫鍵相互作用。
小肽TFEB-p-S211頂部主要是通過S209側鏈以及E182與YWHAB形成氫鍵相互作用，中部通過R129、R58、Y130、K51以靜電荷和氫鍵相互作用協同幫助YWHAB 與 TFEB-p-S211結合，小肽TFEB-p-S211下部作用界面主要以疏水相互作用構成（圖3）。
圖3. LECT2與Tie1直接結合
作者對現有的YWHA/14-3-3三種結合基序進行了分析，已報道的YWHA/14-3-3與 mode I/II 磷酸化小肽復合物結構中，-3 或-4 位的精氨酸在頂部結合區域，與YWHA/14-3-3的底物結合凹槽形成靜電相互作用。
mode III結合模式是識別羧基端末尾的磷酸化小肽，N 端的精氨酸消失。而文中提及的TFEB-p-S211結合YWHA/14-3-3 是一種新型非經典的結合方式，缺少 N 端的靜電作用，但是多出了 C 端的疏水作用和氫鍵相互作用。因此，作者把它定義為 mode IV（圖4）。
圖4. LECT2中斷Tie1 / Tie2異二聚化，Tie1對LECT2的功能行使發揮重要作用
作者通過對TFEB 全長蛋白進行了定點突變以破壞小肽與蛋白的相互作用界面，看是否能對TFEB 的亞細胞定位造成影響（圖5. A、B）。
實驗表明靜息態的細胞在營養充足的條件下，被mTORC1磷酸化的TFEB通過與銜接蛋白YWHA/14-3-3的相互作用被滯留在細胞質中；而在細胞處于饑餓或者溶酶體功能障礙的狀態下，鈣調磷酸酶（calcineurin）使TFEB去磷酸化，導致TFEB與YWHA/14-3-3分離并進入細胞核激活TFEB靶基因的轉錄。
因此YWHA/14-3-3是TFEB在細胞質和細胞核之間位置轉換的關鍵調控因子?；谏鲜鰧嶒灲Y果作者提出了潛在的 YWHA/14-3-3 蛋白調節 TFEB 入核機制模型圖（圖5. C）。TFEB 的核定位序列與YWHA/14-3-3 結合位點 S211空間距離很近，當 TFEB 和 YWHA/14-3-3蛋白結合可能會誘導pS211 和 NLS 之間的區域發生構象變化，使 NLS 序列被遮擋從而導致不能細胞核錨定。
反之經過饑餓處理后，S211位點被去磷酸化，TFEB 和 YWHA/14-3-3蛋白分離，NLS 序列暴露出來，從而介導細胞核錨定和入核。
圖5. YWHA/14-3-3蛋白和 TFEB 之間的作用關系調控 TFEB 亞細胞定位
總結
1、 解析了YWHA/14-3-3蛋白的兩種亞型分別與TFEB-p-S211復合物的結構；
2、 提出YWHA/14-3-3蛋白通過非典型模式識別TFEB-p-S211；
3、 提出可能的 YWHA/14-3-3 蛋白調節 TFEB 入核機制
吉凱助力
該研究的Co-IP實驗部分，TFEB及其突變體的質粒均由吉凱基因設計構建，所用載體為pcDNA3.1-3×FLAG。其轉染HeLa細胞后有效的過表達TFEB及其突變體蛋白（圖6），進而幫助證明了只有S211位點突變后會影響YWHA/14-3-3和TFEB的相互作用。
圖6. Western blot檢測TFEB及其突變體過表達效果
吉凱基因，年產上萬次慢病毒、腺病毒、腺相關病毒；
建有國內大型的慢病毒文庫，包含幾乎覆蓋人類所有基因的，近 15 萬個獨立克隆；
國內集產品采購和資訊分享的一體化綜合服務平臺，為科研工作者提供一鍵式的采購服務，產品周期短至 5 個工作日起；
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