編者按
類器官為腫瘤等疾病的臨床前研究或機(jī)制研究提供了很好的平臺(tái)，其作為一個(gè)有力的體外模型大大助力了癌癥研發(fā)及藥物篩查，在膽囊癌這一疾病上也不例外，膽囊癌類器官及正常膽囊類器官為膽囊癌的發(fā)病以及用藥產(chǎn)生了巨大的推力。
今天，我們回顧了一項(xiàng)于2022年12月發(fā)表在《Clinicaland Translational Medicine》的經(jīng)典研究——《Patient-derived organoids for personalized gallbladder cancer modelling and drug screening》，該研究將患者來(lái)源的膽囊癌類器官作為了學(xué)術(shù)研究和個(gè)性化醫(yī)療的有價(jià)值的臨床前模型。
一、研究背景
膽囊癌（GBC）是膽道癌中最常見的類型，是第六大最常見的胃腸道惡性腫瘤。手術(shù)切除是唯一可以治愈局部GBC患者的方法，但復(fù)發(fā)率可高達(dá)65%，當(dāng)然也有輔助治療策略，包括化療、放療或聯(lián)合治療，然而治療效果并不令人滿意，迫切的需要開發(fā)更加個(gè)性化和針對(duì)性的治療方法。
類器官是最近開發(fā)的三維（3D）培養(yǎng)技術(shù)，它表征了原代組織的結(jié)構(gòu)和功能。來(lái)源于單個(gè)腫瘤患者的患者來(lái)源類器官（PDO）可以大量擴(kuò)增并準(zhǔn)確概括原始腫瘤的形態(tài)和分子特征。本研究通過使用類器官培養(yǎng)技術(shù)，研究人員建立了來(lái)源于人正常膽囊、良性膽囊腺瘤（GBA）和GBC組織的類器官。分析了類器官的形態(tài)、遺傳特征、轉(zhuǎn)錄譜和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。最后，作者篩選了一系列化合物，以確定可以有效抑制GBC類器官生長(zhǎng)的藥物。
二、主要研究成果
1、建立源自人正常膽囊、良性GBA和GBC組織的類器官
作者收集了41名未經(jīng)治療的GBC患者和5名未經(jīng)治療的GBA患者的手術(shù)切除腫瘤組織，并成功建立了五個(gè)GBC類器官系和兩個(gè)GBA類器官系。這些類器官擴(kuò)增至少10代并穩(wěn)定培養(yǎng)3個(gè)月以上。作者將連續(xù)維持超過3個(gè)月的類器官定義為成功建立。同時(shí)，作者從健康的正常膽囊中建立了一種人類正常膽囊類器官，該膽囊表現(xiàn)出單層上皮囊性結(jié)構(gòu)，源自GBA和GBC的類器官表現(xiàn)出不規(guī)則形狀的囊狀篩狀結(jié)構(gòu)。在組織學(xué)水平上，健康的膽囊衍生類器官培養(yǎng)形成囊狀中空結(jié)構(gòu)，類似于正常的膽囊組織。
相比之下，GBA和GBC衍生的類器官顯示出不同的組織學(xué)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，腺體區(qū)域和腫瘤細(xì)胞以篩狀結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，與相應(yīng)的原代組織一致。免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）分析表明，所有類器官及其親本組織都保留了膽道上皮標(biāo)志物CK7的表達(dá)，這些結(jié)果表明，長(zhǎng)期培養(yǎng)的膽囊類器官在組織學(xué)特征和標(biāo)志物表達(dá)方面密切再現(xiàn)了其原始腫瘤組織 。
圖1 建立源自人正常膽囊、良性GBA和GBC組織的類器官
2、正常膽囊、GBA和GBC類器官保留其原始組織的基因組特征
作者為了確定類器官是否保留其親本組織的突變特征，對(duì)類器官和相應(yīng)的原代組織進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序（WES）分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)類器官保留了其配對(duì)原代組織中80%-90%的變異。作者鑒定了癌癥相關(guān)基因的變異，包括GBC類器官中的TP53、MUC4、MUC16、CTNNA2、TTN、RYR2、MGAT5B、USP29和AKAP6以及GBA類器官中的CTNNA2、CTNNB1、KCNIP3和DSCAML1。這些結(jié)果表明，由GBA和GBC產(chǎn)生的類器官概括了在人類膽囊腫瘤中觀察到的突變特征和腫瘤特異性突變。
圖2 正常膽囊、GBA和GBC類器官保留其原始組織的基因組特征
3、類器官及其原始組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
作者為了進(jìn)一步測(cè)試類器官，使用RNA測(cè)序（RNA-seq）分析，將類器官的基因表達(dá)譜與原代組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較。使用健康的膽囊衍生類器官和原始組織作為對(duì)照，基因表達(dá)譜的相關(guān)分析表明，單個(gè)類器官系與其原始組織和腫瘤類型相關(guān)。
接下來(lái)，對(duì)各組間差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)了許多信號(hào)通路，包括JAK-STAT、mTOR、氧化磷酸化和p53信號(hào)通路，它們可以很好地區(qū)分正常膽囊、GBA和GBC組織，組織與匹配的類器官之間的輪廓相似。
為了進(jìn)一步確認(rèn)類器官系中特定基因及其相應(yīng)親本組織中的表達(dá)狀態(tài)，對(duì)信號(hào)通路中的一組基因進(jìn)行了分層聚類分析。與之前的數(shù)據(jù)一致，在GBA和GBC類器官中觀察到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)（RPS6KB1、PIK3R3、MAP3K1、MAP3K2、MAP3K7和CCNE2）、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)傳導(dǎo)（TAB2、PKN2、CREB1），氧化磷酸化途徑（COX6B2、ATP6V1C2），Ras信號(hào)傳導(dǎo)（PDGFC、ELK1和KITLG）和HDAC1、HDAC2、HDAC6中的基因異常和逐漸激活，與原始組織的表達(dá)模式非常相似。
圖3 類器官系及其原始組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析
4、類器官及其原始組織的單細(xì)胞RNA測(cè)序
為了驗(yàn)證類器官的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性中的可重復(fù)性，作者使用三個(gè)樣本生成了基于液滴的單細(xì)胞RNA測(cè)序（sc-RNA seq）譜：GBA-2組織（GBA-2_T），GBC-4組織（GBC-4_T）和匹配的GBC-4類器官（GBC-4_O）。經(jīng)過質(zhì)量控制和雙峰去除，作者總共獲得了7124個(gè)單細(xì)胞。在基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化后，作者采用UMAP方法來(lái)降維。
這些細(xì)胞被分配到七個(gè)主要的不同細(xì)胞類型簇：上皮細(xì)胞（EPCAM）；間充質(zhì)細(xì)胞（COL1A1和PDGFRB）；內(nèi)皮細(xì)胞（PECAM1和CD34）；T細(xì)胞（CD3E）；B細(xì)胞（CD79A和MZB1）；骨髓細(xì)胞（CD14和CD163）和肥大細(xì)胞（TPSAB1和KIT）。通過預(yù)測(cè)大規(guī)模染色體CNV，上皮細(xì)胞和來(lái)自良性GBA-2的染色體畸變存在多種譜，預(yù)測(cè)CNV要低得多。然而，預(yù)測(cè)的CNV在GBC-4組織的上皮細(xì)胞和匹配的類器官之間高度一致。
總之，這些數(shù)據(jù)表明GBC衍生的類器官可以在單細(xì)胞分辨率下概括其衍生組織的轉(zhuǎn)錄特征和異質(zhì)性。
圖4 類器官培養(yǎng)物及其原始組織的單細(xì)胞RNA測(cè)序
5、用于體外患者特異性藥物試驗(yàn)的GBC類器官
為了開發(fā)更有效的抗GBCs藥物，作者選擇了29種化合物，靶向腫瘤中常見的信號(hào)通路，并評(píng)估了它們抑制GBC類器官活力的療效。作者首先研究了這些抑制劑對(duì)正常膽囊類器官的毒性，九種化合物（例如地蘭佐米、曲美替尼和普西諾他）對(duì)正常類器官有顯著的抑制作用。作者進(jìn)一步應(yīng)用剩余的20種化合物來(lái)檢查GBC類器官的藥物反應(yīng)。
應(yīng)該注意的是，不同的GBC類器官表現(xiàn)出不同的藥物反應(yīng)，所有這些GBC類器官對(duì)靶向JAK、PI3K、MAPK、RAF、PARP、AMPK和Hedgehog的各種抑制劑具有廣泛的耐藥性。伏立諾他和姜黃素——HDAC抑制劑，有效地抑制了GBC類器官的生長(zhǎng)，此外，類器官系中不同劑量的伏立諾他治療以劑量依賴性方式證明了對(duì)GBC類器官的抑制作用，IC50從1.11到18.05 μM，表明HDAC抑制劑是對(duì)抗GBC類器官的潛在藥物。
圖5 膽囊癌 （GBC） 類器官用于體外藥物篩選
6、GBC組織中HDAC1、-2和-6的過表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良
為了探討HDACs在GBC中表達(dá)的臨床意義，作者在人GBC（100個(gè)樣本）和正常膽囊（10個(gè)樣本）組織中進(jìn)行了IHC染色。與正常膽囊組織相比，GBC組織中HDAC1，-2和-6的表達(dá)水平明顯上調(diào)。根據(jù)HDAC1、-2和-6在腫瘤組織中表達(dá)的IHC結(jié)果，將所有100個(gè)GBC樣品分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。統(tǒng)計(jì)分析顯示， HDAC1高表達(dá)組的淋巴結(jié)狀態(tài)較差（P=0.003）和腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（TNM）分期為晚期（P = 0.01）；HDAC2高表達(dá)組肝臟浸潤(rùn)患者較多（P = 0.03）。這些發(fā)現(xiàn)證明HDAC1、-2和-6是GBC預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子，這進(jìn)一步表明了HDAC抑制劑的治療價(jià)值。
圖6 GBC中組蛋白去乙酰化酶（HDAC1）、-2和-6的上調(diào)與預(yù)后不良
共抑制HDAC和其他促腫瘤信號(hào)通路協(xié)同抑制GBC類器官生長(zhǎng)
鑒于HDACs和GBC中其他促腫瘤信號(hào)通路（如PI3K-AKT和Ras信號(hào)傳導(dǎo)）的共同共激活，作者旨在確定這些通路與HDAC的聯(lián)合抑制是否對(duì)GBC患者具有協(xié)同抗腫瘤作用。此外，在GBC類器官衍生的異種移植模型中，伏立諾他或CUDC-907治療均造成了腫瘤生長(zhǎng)抑制，并且正如預(yù)期的那樣，PI3K-HDAC雙重抑制劑CUDC-907表現(xiàn)出比伏立諾他更強(qiáng)的抗腫瘤活性。
這些結(jié)果表明，抑制促腫瘤信號(hào)通路和HDAC可能是GBC患者的可行治療策略。
圖7 共抑制HDAC和其他促腫瘤信號(hào)通路協(xié)同抑制GBC類器官生長(zhǎng)
三、編者點(diǎn)評(píng)
作者通過測(cè)試GBC類器官對(duì)每個(gè)生態(tài)因子的依賴性，優(yōu)化了GBC類器官培養(yǎng)基的組成，從而大大降低了研發(fā)成本。為了評(píng)估GBC類器官作為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)工具的價(jià)值，作者通過H&E染色、免疫組織化學(xué)和免疫熒光鑒定類器官培養(yǎng)物的組織病理學(xué)特征，通過全外顯子組測(cè)序和RNA測(cè)序分析類器官的遺傳和轉(zhuǎn)錄特征，篩選了一組靶向GBC中最活躍信號(hào)通路的化合物。綜上所述，GBC類器官保留了其原有腫瘤組織的特征，可推進(jìn)GBC的基礎(chǔ)研究，促進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展！
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展科研服務(wù)CRO、智慧實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和精準(zhǔn)醫(yī)療三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特類器官平臺(tái)已建立膽囊癌及多種癌種的類器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！
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