編者按
類器官為腫瘤等疾病的臨床前研究或機制研究提供了很好的平臺，其作為一個有力的體外模型大大助力了癌癥研發及藥物篩查，在膽囊癌這一疾病上也不例外，膽囊癌類器官及正常膽囊類器官為膽囊癌的發病以及用藥產生了巨大的推力。
今天，我們回顧了一項于2022年12月發表在《Clinicaland Translational Medicine》的經典研究——《Patient-derived organoids for personalized gallbladder cancer modelling and drug screening》，該研究將患者來源的膽囊癌類器官作為了學術研究和個性化醫療的有價值的臨床前模型。
一、研究背景
膽囊癌（GBC）是膽道癌中最常見的類型，是第六大最常見的胃腸道惡性腫瘤。手術切除是唯一可以治愈局部GBC患者的方法，但復發率可高達65%，當然也有輔助治療策略，包括化療、放療或聯合治療，然而治療效果并不令人滿意，迫切的需要開發更加個性化和針對性的治療方法。
類器官是最近開發的三維（3D）培養技術，它表征了原代組織的結構和功能。來源于單個腫瘤患者的患者來源類器官（PDO）可以大量擴增并準確概括原始腫瘤的形態和分子特征。本研究通過使用類器官培養技術，研究人員建立了來源于人正常膽囊、良性膽囊腺瘤（GBA）和GBC組織的類器官。分析了類器官的形態、遺傳特征、轉錄譜和腫瘤內異質性。最后，作者篩選了一系列化合物，以確定可以有效抑制GBC類器官生長的藥物。
二、主要研究成果
1、建立源自人正常膽囊、良性GBA和GBC組織的類器官
作者收集了41名未經治療的GBC患者和5名未經治療的GBA患者的手術切除腫瘤組織，并成功建立了五個GBC類器官系和兩個GBA類器官系。這些類器官擴增至少10代并穩定培養3個月以上。作者將連續維持超過3個月的類器官定義為成功建立。同時，作者從健康的正常膽囊中建立了一種人類正常膽囊類器官，該膽囊表現出單層上皮囊性結構，源自GBA和GBC的類器官表現出不規則形狀的囊狀篩狀結構。在組織學水平上，健康的膽囊衍生類器官培養形成囊狀中空結構，類似于正常的膽囊組織。
相比之下，GBA和GBC衍生的類器官顯示出不同的組織學和細胞結構，腺體區域和腫瘤細胞以篩狀結構生長，與相應的原代組織一致。免疫組化（IHC）和免疫熒光（IF）分析表明，所有類器官及其親本組織都保留了膽道上皮標志物CK7的表達，這些結果表明，長期培養的膽囊類器官在組織學特征和標志物表達方面密切再現了其原始腫瘤組織 。
圖1 建立源自人正常膽囊、良性GBA和GBC組織的類器官
2、正常膽囊、GBA和GBC類器官保留其原始組織的基因組特征
作者為了確定類器官是否保留其親本組織的突變特征，對類器官和相應的原代組織進行了全外顯子組測序（WES）分析，發現每個類器官保留了其配對原代組織中80%-90%的變異。作者鑒定了癌癥相關基因的變異，包括GBC類器官中的TP53、MUC4、MUC16、CTNNA2、TTN、RYR2、MGAT5B、USP29和AKAP6以及GBA類器官中的CTNNA2、CTNNB1、KCNIP3和DSCAML1。這些結果表明，由GBA和GBC產生的類器官概括了在人類膽囊腫瘤中觀察到的突變特征和腫瘤特異性突變。
圖2 正常膽囊、GBA和GBC類器官保留其原始組織的基因組特征
3、類器官及其原始組織的轉錄組學分析
作者為了進一步測試類器官，使用RNA測序（RNA-seq）分析，將類器官的基因表達譜與原代組織的基因表達譜進行比較。使用健康的膽囊衍生類器官和原始組織作為對照，基因表達譜的相關分析表明，單個類器官系與其原始組織和腫瘤類型相關。
接下來，對各組間差異表達基因（DEGs）進行基因集富集分析（GSEA），值得注意的是，作者發現了許多信號通路，包括JAK-STAT、mTOR、氧化磷酸化和p53信號通路，它們可以很好地區分正常膽囊、GBA和GBC組織，組織與匹配的類器官之間的輪廓相似。
為了進一步確認類器官系中特定基因及其相應親本組織中的表達狀態，對信號通路中的一組基因進行了分層聚類分析。與之前的數據一致，在GBA和GBC類器官中觀察到絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導（RPS6KB1、PIK3R3、MAP3K1、MAP3K2、MAP3K7和CCNE2）、PI3K-AKT-mTOR信號傳導（TAB2、PKN2、CREB1），氧化磷酸化途徑（COX6B2、ATP6V1C2），Ras信號傳導（PDGFC、ELK1和KITLG）和HDAC1、HDAC2、HDAC6中的基因異常和逐漸激活，與原始組織的表達模式非常相似。
圖3 類器官系及其原始組織的轉錄組學分析
4、類器官及其原始組織的單細胞RNA測序
為了驗證類器官的腫瘤內異質性中的可重復性，作者使用三個樣本生成了基于液滴的單細胞RNA測序（sc-RNA seq）譜：GBA-2組織（GBA-2_T），GBC-4組織（GBC-4_T）和匹配的GBC-4類器官（GBC-4_O）。經過質量控制和雙峰去除，作者總共獲得了7124個單細胞。在基因表達標準化后，作者采用UMAP方法來降維。
這些細胞被分配到七個主要的不同細胞類型簇：上皮細胞（EPCAM）；間充質細胞（COL1A1和PDGFRB）；內皮細胞（PECAM1和CD34）；T細胞（CD3E）；B細胞（CD79A和MZB1）；骨髓細胞（CD14和CD163）和肥大細胞（TPSAB1和KIT）。通過預測大規模染色體CNV，上皮細胞和來自良性GBA-2的染色體畸變存在多種譜，預測CNV要低得多。然而，預測的CNV在GBC-4組織的上皮細胞和匹配的類器官之間高度一致。
總之，這些數據表明GBC衍生的類器官可以在單細胞分辨率下概括其衍生組織的轉錄特征和異質性。
圖4 類器官培養物及其原始組織的單細胞RNA測序
5、用于體外患者特異性藥物試驗的GBC類器官
為了開發更有效的抗GBCs藥物，作者選擇了29種化合物，靶向腫瘤中常見的信號通路，并評估了它們抑制GBC類器官活力的療效。作者首先研究了這些抑制劑對正常膽囊類器官的毒性，九種化合物（例如地蘭佐米、曲美替尼和普西諾他）對正常類器官有顯著的抑制作用。作者進一步應用剩余的20種化合物來檢查GBC類器官的藥物反應。
應該注意的是，不同的GBC類器官表現出不同的藥物反應，所有這些GBC類器官對靶向JAK、PI3K、MAPK、RAF、PARP、AMPK和Hedgehog的各種抑制劑具有廣泛的耐藥性。伏立諾他和姜黃素——HDAC抑制劑，有效地抑制了GBC類器官的生長，此外，類器官系中不同劑量的伏立諾他治療以劑量依賴性方式證明了對GBC類器官的抑制作用，IC50從1.11到18.05 μM，表明HDAC抑制劑是對抗GBC類器官的潛在藥物。
圖5 膽囊癌 （GBC） 類器官用于體外藥物篩選
6、GBC組織中HDAC1、-2和-6的過表達預示預后不良
為了探討HDACs在GBC中表達的臨床意義，作者在人GBC（100個樣本）和正常膽囊（10個樣本）組織中進行了IHC染色。與正常膽囊組織相比，GBC組織中HDAC1，-2和-6的表達水平明顯上調。根據HDAC1、-2和-6在腫瘤組織中表達的IHC結果，將所有100個GBC樣品分為低表達組和高表達組。統計分析顯示， HDAC1高表達組的淋巴結狀態較差（P=0.003）和腫瘤淋巴結轉移（TNM）分期為晚期（P = 0.01）；HDAC2高表達組肝臟浸潤患者較多（P = 0.03）。這些發現證明HDAC1、-2和-6是GBC預后不良的預測因子，這進一步表明了HDAC抑制劑的治療價值。
圖6 GBC中組蛋白去乙酰化酶（HDAC1）、-2和-6的上調與預后不良
共抑制HDAC和其他促腫瘤信號通路協同抑制GBC類器官生長
鑒于HDACs和GBC中其他促腫瘤信號通路（如PI3K-AKT和Ras信號傳導）的共同共激活，作者旨在確定這些通路與HDAC的聯合抑制是否對GBC患者具有協同抗腫瘤作用。此外，在GBC類器官衍生的異種移植模型中，伏立諾他或CUDC-907治療均造成了腫瘤生長抑制，并且正如預期的那樣，PI3K-HDAC雙重抑制劑CUDC-907表現出比伏立諾他更強的抗腫瘤活性。
這些結果表明，抑制促腫瘤信號通路和HDAC可能是GBC患者的可行治療策略。
圖7 共抑制HDAC和其他促腫瘤信號通路協同抑制GBC類器官生長
三、編者點評
作者通過測試GBC類器官對每個生態因子的依賴性，優化了GBC類器官培養基的組成，從而大大降低了研發成本。為了評估GBC類器官作為精準醫學工具的價值，作者通過H&E染色、免疫組織化學和免疫熒光鑒定類器官培養物的組織病理學特征，通過全外顯子組測序和RNA測序分析類器官的遺傳和轉錄特征，篩選了一組靶向GBC中最活躍信號通路的化合物。綜上所述，GBC類器官保留了其原有腫瘤組織的特征，可推進GBC的基礎研究，促進精準醫學的發展！
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