編者按
當前，胃癌（GC）是全球第五大常見癌癥、第四大癌癥死亡原因，其發病率在過去幾十年呈上升趨勢。手術切除聯合圍手術期化療是局部晚期胃癌患者的一線治療選擇。然而，胃癌(GC)患者化療的療效差異顯著，目前尚缺少有效的策略來預測化療結果。
2024年7月3日，中山大學研究員李曉星、中山大學/香港中文大學于君教授、中山大學副研究員許麗霞等在Cell Reports Medicine上發表題為“Personalized drug screening using patient-derived organoid and its clinical relevance in gastric cancer”的最新研究成果，該研究從73名胃癌（GC）患者中成功構建了57個胃癌患者來源的類器官(PDOs)，這些類器官保留了其腫瘤結構與功能特征，可用于預測患者對化療藥物的治療反應。因此，評估胃癌類器官的化療敏感性可以作為篩選胃癌患者個性化選擇化療藥物的有力工具。
文章題目
Personalized drug screening using patient-derived organoid and its clinical relevance in gastric cancer
雜志：Cell Reports Medicine（IF=14.3）
發表時間：2024.7.3
作者：于君、許麗霞、李曉星等
單位：中山大學
01、研究亮點
• 構建胃癌（GC）類器官生物樣本庫；
• 識別鑒定與化療藥物敏感性、耐藥性相關的基因表達特征；
• 利用胃癌類器官，在體外、體內再現胃癌患者的化療藥物反應；
• 胃癌類器官可與T細胞及腫瘤相關的成纖維細胞進行共培養。
02、研究背景
胃癌(GC)是全球第五大常見癌癥、第四大癌癥死亡原因，其發病率在過去幾十年呈上升趨勢。手術切除聯合圍手術期化療是局部晚期胃癌患者的一線治療選擇。最常見的常規化療藥物包括氟尿嘧啶(如5-氟尿嘧啶[5-FU]、卡培他濱和替吉奧)和鉑類化合物(如順鉑和奧沙利鉑)。然而，胃癌患者對這些化療藥物的反應差異很大，且原因尚不明確。因此，為提高胃癌患者的化療療效和臨床結果，亟需開發能夠準確預測胃癌患者化療療效的方法。
類器官培養物是三維細胞聚集體。最近的研究表明，患者來源的類器官(PDOs)可以預測患者的治療反應，尤其是PDOs，能夠準確地保留并再現其原始腫瘤的遺傳特性和組織病理學特征，這表明它們在個性化腫瘤治療中的潛在應用。三個獨立的研究小組報告了胃癌患者來源的PDOs的構建情況，并探討了PDOs在預測藥物反應中的應用。然而，這些研究缺乏對化療敏感性相關基因表達特征的探討。來自類器官或原始腫瘤組織的的基因特征有助于識別治療反應的預測性生物標志物。因此，基于PDOs的基因表達和化療敏感性的綜合分析非常重要。
以往對胃癌患者來源的類器官(PDOs)進行藥物篩選的研究樣本量相對較小。通過對大量胃癌患者來源的類器官(PDOs)進行藥物篩選，對于為GC患者提供準確可靠的個性化治療預測是必要的。
在此，研究人員報告了胃癌患者來源的類器官生物庫的建立，并模擬人類胃癌的組織學特征及對不同化療藥物的不同反應。通過RNA測序，在5-氟尿嘧啶(FU)或奧沙利鉑敏感的類器官中發現了腫瘤抑制基因/途徑的上調，而在化療耐藥的類器官中，與增殖和侵襲相關的基因/途徑則豐富。鑒定出能夠區分5-FU和奧沙利鉑敏感和耐藥患者(劑量反應曲線下面積[AUC] >0.8)的基因表達生物標志物面板。
此外，PDOs的藥物反應結果在患者源性類器官異種移植(PDOX)小鼠中得到了驗證，與91.7% (11/12)GC患者的實際臨床反應一致。評估PDOs的化療敏感性可以作為篩選GC患者化療藥物的有價值的工具。
03、研究結果
1. 建立患者來源的胃癌類器官生物庫
研究人員從73例經組織學診斷為胃腺癌的患者手術切除標本中獲取胃腫瘤組織，建立了57個患者來源的胃癌類器官生物庫，成功率為78%（57/73）（圖1A）。具體而言，53個類器官來源于未經治療的患者，4個類器官來源于接受新輔助化療的患者（圖1B）。這些胃癌類器官來自胃的不同部位，如賁門、胃底、胃體、胃竇和胃角等，并涵蓋了不同的腫瘤-結節-轉移（TNM）分期階段，包括I期、II期、III期和IV期（圖1B）。
圖1
不同的胃癌類器官具有不同的生長率。高生長率類器官表現出增殖性祖細胞表型，并形成了無腔球狀、囊樣形態，可連續傳代多達17代，且增殖能力未出現明顯減弱，如G5T、G9T、G27T、G30T和G72T）（圖1C）；而低生長速率類器官具有腺體形態，出現管腔，8-9代后就無法進一步傳代（圖1C）。因此，實驗結果表明已成功建立患者來源的胃癌類器官（Patient-Derived Organoids, PDOs）生物庫，這些類器官具有不同的生長特征，如高生長率或低生長率。
2. 闡明高生長率或低生長率類器官的基因表達譜
RNA測序結果顯示，高生長率與低生長率胃癌類器官之間存在顯著的基因表達差異（圖1D）。高生長率類器官中，增殖和干性相關基因，如REG4、KLF4、ERBB3、HRAS、NOTCH1和MYC等顯著上調（圖1E），而低生長率類器官中，抑制細胞生長的基因，如BAX、DKK3、TNFSF12、MCC、BNIP3和TP53BP1，則呈現下調趨勢（圖1D和1E）。
進一步進行KEGG通路分析證實，高生長率類器官中增殖和干性相關通路顯著上調，如MAPK家族信號級聯反應和NOTCH信號，均能促進細胞增殖并維持干細胞功能（圖1F）。與低生長率類器官相比，高生長率類器官中細胞分化和凋亡相關通路均相對下調，如Hippo信號通路和p53信號通路（圖1F）。
此外，研究人員分析發現類器官生長率（高生長率與低生長率）與臨床病理特征之間無顯著相關性（表S2）。通過全外顯子組測序顯示，高生長率與低生長率類器官在基因突變方面無顯著差異，包括TP53、CDH1、ARID1A、MUC6和RNF43等已知的驅動突變（圖S1）。因此，高生長率與低生長率類器官具有不同的基因表達模式，高生長率類器官表現出更強的增殖與干細胞特性，也一定程度上解釋了它們在生長特征上的差異。
3. 胃癌類器官及其對應腫瘤組織的基因表達分析
隨后，研究人員探究了類器官培養中如何維持穩定的腫瘤特異性基因表達。通過RNA測序結果發現，類器官與其對應的原發腫瘤組織在基因表達模式上具有高度的相似性（圖2A和2B）。通過定量分析比較RNA測序的替代轉錄本水平的基因表達，結果顯示，匹配的類器官與原發腫瘤在基因表達上呈現出高度的一致性（圖S2A）。
圖2
4. 胃癌類器官保留了原發胃癌的組織病理學特征
研究人員評估了胃癌類器官能否保留其來源的腫瘤組織學特征和蛋白質表達。結果顯示，胃癌類器官保留了其對應的原發腫瘤特定腺體特征，包括腺體、離散性或實性生長模式及核分層（圖2C和S2B）。
此外，這些類器官還表現出與其對應的原發腫瘤亞型相似的組織學特征，如彌漫型、腸型和混合型胃癌等。其中，源自腸型腫瘤（G20T和G43T）的胃癌類器官呈現出由單個上皮層或篩狀腺體形態構成的大球體，細胞形成多個大小不一的腔隙；源自彌漫型腫瘤（G27T和G72T）的胃癌類器官，形成松散的實性細胞簇或囊性結構（G24T和G39T）；而源自混合型胃癌（G36T和G41T）的胃癌類器官，則表現出彌漫型和腸型腫瘤的混合組織學模式（圖2C和S2B）。
為了進一步確認胃癌類器官保留了其來源腫瘤的特性，研究人員對胃癌標志物細胞角蛋白7（CK7）和癌胚抗原（CEA）的蛋白表達進行了免疫組織化學分析。如圖2D、S2C所示，胃癌類器官與對應的原發腫瘤中的蛋白質標記物的存在和強度相似；CK7和CEA強度的Allred評分高度相關（圖S2D）。鑒于腫瘤組織的異質性，研究人員還檢查了表達強度不一致的病例，并發現CK7（在G43T和G56T中）和CEA（在G62T和G56T中）在原發腫瘤和類器官之間的表達強度存在差異（圖S2D）。
這些結果表明，胃癌類器官保留了其原發腫瘤的組織病理學特征，因此，患者來源的胃癌類器官（GC PDOs）可以在藥物測試中有效模擬個體患者的原發胃癌。
5. 患者來源的胃癌類器官對化療藥物的篩選
為了探索胃癌類器官對不同藥物的反應，研究人員選擇了6種常規化療藥物（5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑、順鉑、紫杉醇、多柔比星和SN-38）對41種胃癌類器官進行了測試，每種藥物在5個不同濃度下進行三次重復篩選。為了評估每種類器官對不同濃度藥物的反應情況，對每個類器官系的兩個不同傳代均在不同濃度下進行處理。結果發現，同一類器官系兩個傳代的生物重復樣本的劑量-反應曲線（DRC）下面積（AUC）值高度相關，表明培養系統是穩定的，不受外部條件及類器官傳代差異的影響（圖3A和S3A）。
為了確保半數抑制濃度（IC50）估計的準確性，研究人員使用了額外的濃度系統來測試藥物的敏感性。分析表明，同一類器官系的兩組藥物濃度（十濃度和五濃度）的AUC值和IC50值具有高度的相關性（圖S3B和S3C）；不同胃癌患者的類器官對化療藥物的反應各不相同（圖3B；表S3）。一些類器官對5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑、順鉑、紫杉醇、SN-38和多柔比星等具有耐藥性，而有的則表現出部分敏感或敏感（圖3C），如彌漫型胃癌生成的類器官更可能對5-FU和紫杉醇敏感（圖3C）。
這些結果表明，患者來源的胃癌類器官是藥物篩選的潛在有效工具，對不同常規化療藥物的反應各不相同。
圖3
6. 患者來源的胃癌類器官對化療藥物的基因表達特征分析
為了評估胃癌患者對5-氟尿嘧啶（5-FU）或奧沙利鉑這兩種最常用的化療藥物的反應，研究人員通過轉錄組測序分析了17個PDOs的基因表達特征。
基于這些胃癌類器官對5-FU和奧沙利鉑的反應，將其分為敏感組和耐藥組（敏感：AUC < 50%；耐藥：AUC ≥ 50%）。通過比較敏感組與耐藥組的基因表達譜，發現在5-FU敏感組（n = 13）和耐藥組（n = 4）的胃癌類器官中基因表達存在顯著差異（圖4A）。與5-FU耐藥組相比，敏感組中的腫瘤抑制基因顯著上調，包括MSMB、S1PR4、PURPL、TP53INP1和TRIM16等（圖4B）。
KOBAS分析表明，5-FU敏感類器官中，腫瘤抑制性p53信號通路和細胞凋亡顯著上調（圖4C），而與增殖和侵襲相關的基因在敏感組中顯著下降，如FKBP10、DARPP32、ASCL2、BCL2、ABCC2和NOTCH1（圖4A和4B）。這些基因富集于腫瘤侵襲和干細胞相關的通路中，包括NOTCH信號通路、WNT信號通路、Rho GTP酶信號通路和細胞外基質組織（圖4C）。
圖4
在對11個奧沙利鉑敏感的胃癌類器官和6個耐藥的胃癌類器官中也觀察到了基因表達的顯著差異（圖4D）。與耐藥組相比，奧沙利鉑敏感組類器官中腫瘤抑制相關基因顯著上調，包括MYO1A、CLDN3、DMBT1、TNFRSF1B和TRIM15（圖4E）。這些上調的基因主要富集在腫瘤抑制途徑中，特別是腫瘤壞死因子（TNF）信號和FOXO信號（圖4F），而在敏感組中，與增殖和侵襲相關的基因顯著下降，包括NDUFA4L2、DKK4、KLK10、FOSL1、STC2和L1CAM（圖4E），這些基因涉及PI3K信號和WNT信號增殖途徑（圖4F）。綜上所述，我們揭示了胃癌類器官對化療藥物的基因表達特征。
此外，研究人員還在胃癌類器官中敲除RNA測序鑒定的敏感或耐藥基因以進行，證實了這些基因在類器官中對5-FU和奧沙利鉑治療反應的功能影響。
7. 胃癌類器官對化療藥物反應的基因突變特征
為了研究類器官對化療藥物的突變譜，研究人員通過全外顯子組測序發現，在基因突變方面，5-FU敏感型與耐藥型類器官沒有顯著差異，包括胃癌中常見的ARID1A、TP53、KRAS、CDH1和PIK3CA突變（圖S4A）。然而，與耐藥組相比，奧沙利鉑敏感組突變更多，其中,MUC6、ARID1A和RIMS2突變頻率最高（圖S4B）。
8. 胃癌患者化療基因表達生物標志物的鑒定
接著，研究人員通過遞歸特征消除算法研究了腫瘤組織的基因表達生物標志物，這9個具有顯著差異表達的基因能夠區分5-FU治療的敏感患者和耐藥患者，包括6個上調基因（RNASEH2A、MMP3、CXCL1、COL5A2、MXRA5和PTTG1）和3個下降基因（SLC2A1、RRAD和APLP1）。與5-FU耐藥患者的腫瘤組織相比，它們具有顯著差異（圖5A）。
接著，通過邏輯回歸模型和樸素貝葉斯模型對這些生物標志物的準確性和有效性進行了驗證。與耐藥組相比，奧沙利鉑敏感組的腫瘤組織中鑒定出6個差異表達基因，包括3個上調基因（TNFSF9、WNT2和EGR3）和3個下調基因（MT2A、SULT2B1和ALDOB）（圖5C）。這些發現表明，該基因表達生物標志物組能夠區分對5-FU和奧沙利鉑化療敏感的患者與耐藥患者。
圖5
此外，在另一組隊列（癌癥基因組圖譜[TCGA]）中驗證了這一基因特征，并分析了其與生存曲線的相關性。生存分析顯示，在5-FU治療組（n=68）中，敏感組的患者無進展生存期預后更好（p<0.05）（圖S5A），但無法在兩組患者的預后中識別出顯著差異（圖S5B），邏輯回歸和樸素貝葉斯模型也證實了研究中這些組的有效性（圖S6A和S6B）。
圖6
9. 在小鼠PDOX模型中驗證GC PDOs的藥物反應
為了驗證在胃癌PDOs中的藥物反應狀態，研究人員建立了小鼠PDOX模型。通過在小鼠體內植入不同的胃癌類器官，發現G5T-PDOs對紫杉醇敏感，表現為腫瘤生長（圖6C）和腫瘤重量（圖6D）顯著減少；對5-FU呈現出耐藥性（圖6B）。而且，與未治療的對照組相比，紫杉醇治療的G5T-PDOXs中的細胞增殖顯著減少（p < 0.001），而細胞凋亡顯著增加（p < 0.01），而在5-FU治療組中未發現這種差異（圖6E）。
此外，G9T-PDOs對5-FU敏感，對奧沙利鉑呈現出耐藥性（圖6F）。5-FU治療后，與未治療的G9T-PDOXs相比，G9T-PDOXs中的細胞增殖顯著減少（p < 0.0001），細胞凋亡顯著增加（p < 0.01），而在奧沙利鉑治療組中未觀察到差異（圖6I）。
G27T-PDOs對5-FU、奧沙利鉑和紫杉醇均敏感（圖S7A），腫瘤生長和腫瘤重量也顯著減少（圖S7B和S7C）；G30T-PDOs對奧沙利鉑和紫杉醇敏感，但對5-FU部分耐藥（圖S7D）；G72T-PDOXs對5-FU、奧沙利鉑和SN-38敏感，也與G72T-PDOs的藥物試驗結果一致（圖S7G–S7I）。
這些實驗結果表明，在胃癌器官培養中觀察到的藥物反應在PDOX體內模型中得到了驗證。
圖7
10. 在隨訪的胃癌患者中驗證GC PDOs的藥物反應
通過實際臨床治療和隨訪中，研究人員驗證了GC PDOs的藥物敏感或耐藥結果。隨訪12名接受化療的胃癌患者，并結合其來源的類器官藥物篩選結果（圖6J和6K），發現有11名（91.7%）的藥物反應結果與其來源的PDOs一致（圖6K）。如，G32T患者被診斷為局部晚期胃癌，接受術后奧沙利鉑和S-1輔助化療，隨訪35個月無腫瘤復發，與實際臨床反應一致，來源于G32T的類器官對聯合治療也很敏感。這些結果表明，GC PDOs的藥物反應可在其對應的隨訪胃癌患者中得到驗證，GC PDOs是藥物篩選和預測患者藥物反應的有力工具。
11. 類器官模型作為研究腫瘤微環境細胞與腫瘤細胞相互作用的平臺
為了探討類器官與成纖維細胞（CAFs）共培養的可能性，研究人員將胃癌類器官（G83T和G84T）與匹配的腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）進行共培養。3天后，CAFs生長并逐漸形成包圍類器官的網狀結構（圖7A）；5天后，類器官體積顯著增大（圖7B和S8）。
隨后，研究了在5-FU和奧沙利鉑作用下，CAFs對腫瘤類器官的影響。結果顯示，CAFs顯著增強了兩種類器官（G83T和G84T）對5-FU和奧沙利鉑的耐藥性（圖7C）。與單獨培養的類器官相比，共培養的類器官（G27T和G72T）增強了對藥物的耐藥性（圖7D）。
為了進一步探究類器官與免疫細胞的相互作用，將來自三名患者的胃癌類器官與自體T細胞共培養。經過2周的共培養和刺激后，在G72T患者（MSI-H）中，暴露于自體腫瘤類器官的PBMCs干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）腫瘤反應性T細胞顯著增加；G83T患者（MSS）中，IFN-γ略有增加，TNF-α腫瘤反應性T細胞顯著增加；而G85T患者（MSS）中，IFN-γ略有增加，TNF-α腫瘤反應性T細胞減少（圖S9A）。因此，這些患者特異的腫瘤反應性T細胞可用于共培養試驗，以評估它們在類器官中的腫瘤殺傷作用。
綜上所述，實驗結果表明，通過PBMCs和自體腫瘤類器官的共培養，從而誘導患者特異的腫瘤反應性T細胞反應是可行的。自體T細胞的加入，通過免疫熒光染色可發現G72T類器官結構損傷、凋亡增加（圖7E）；流式細胞術證實，與T細胞共培養后，腫瘤細胞凋亡增加（圖S9B），而在與T細胞共培養的G83T和G85T類器官中，未觀察到此現象（圖7E和S9B）。這些實驗結果能驗證腫瘤微環境細胞與腫瘤細胞之間的相互作用，以便深入了解這些相互作用如何影響治療效果。
04、編者點評
綜上，本研究建立了患者來源的胃癌類器官生物樣本庫，并分析了胃癌PDO的分子特征，還利用基于患者來源類器官的異種移植（PDOX）模型來驗證PDO藥物敏感性測試的結果，并進一步用胃癌個體患者的實際治療反應進行驗證。 這些結果表明，利用患者來源的胃癌類器官進行化療敏感性評估，可作為胃癌患者化療藥物篩選的有價值工具。
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