百螢生物為您總結的關于鈣黃綠素實驗中可能會遇到的相關問題

1.鈣黃綠素產品的用途是什么？

答：鈣黃綠素是用來標記和監測活細胞的細胞功能的一類熒光探針/試劑盒。它只針對活細胞進行染色，不能染已固定的細胞。

注：染色時間不可太久，保持在內，后，熒光會變得不明顯。

2.鈣黃綠素中帶AM與不帶AM的探針有什么區別？它們的優點是什么？

答：不帶AM的探針可以直接注射進入細胞，而帶AM的探針，因為AM 具有細胞膜滲透性，一旦進入細胞，被細胞內酯酶水解為鈣黃綠素（Calcein），產生強烈的綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因不具細胞膜滲透性，從而能被保留在細胞內。Calcein Red和Calcein Deep Red兩種類似物，使其能夠替代Calcein AM用在活細胞的標記和功能分析的多重標記研究。AM酯是非極性酯，其易于穿過活細胞膜，并且通過活細胞內的細胞酯酶快速水解。AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針加載到活細胞中。但是，使用AM酯時必須小心，因為它們易于水解，特別是在溶液中。它們應在使用前重新配制成高質量的無水二甲基亞砜（DMSO）。DMSO儲備溶液可以在-20℃下干燥儲存并避光。在這些條件下，AM酯可以穩定數個月。

3.鈣黃綠素的染色過程需要注意哪些問題？

答：細胞離心，去培養基，清洗細胞1~2次，以充分去除殘留的培養基，稀釋成工作濃度為2-5μM (PBS 或 HBSS-HEPES） 有時可添加一定量的非離子表面活性劑如Pluronic F127到Calcein Red ™儲存液內來增強其水溶性37℃ 孵育20min～1h用PBS（或者其他緩沖液）洗滌細胞兩次去除多余染料。

注：1.細胞活力理想的濃度范圍應在4-5μM

       2.如果細胞中含有有機陰離子轉運蛋白，可以在細胞培養基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化。

       3.因為背景高的原因，需要多清洗細胞幾次去除多余染料。

4.鈣黃綠素適用于哪些儀器？

答：熒光顯微鏡、流式細胞儀

注：使用流式細胞儀時需要立即分析細胞樣品，以確定在零時間沒有洗滌的每個細胞的平均熒光。

5.鈣黃綠素與其他活細胞染料相比有何優勢？

答：鈣黃綠素與其他同類產品（如CFDA、CFSE等）相比是特別適合染活細胞的熒光探針，因為它的毒性特別低。并且它不會抑制細胞的各種功能，如增殖、趨化性等。

注：鈣黃綠素和碘化丙啶（PI）常用于鑒別死活細胞。鈣黃綠素的親脂性很高，可以通過細胞膜，脫去AM后發生強烈綠色熒光；而碘化丙啶（PI）不能通過活細胞的細胞膜，它僅可以穿過死細胞膜，嵌入其DNA螺旋產生紅色熒光。由于鈣黃綠素與碘化丙啶在490nm處均可被激發，545nm激發僅可觀察死細胞。因此，他們被用于活細胞和死細胞雙重染色。

6.鈣黃綠素在作為顯色劑時如何很好的溶解？

答：鈣黃綠素在在1mol/L的氫氧化鈉溶液中，溶解度能達到50mg，并且超聲助溶不會破壞其結構。