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RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修飾通過(guò)影響mRNA穩(wěn)定性、翻譯、轉(zhuǎn)位調(diào)控RNA代謝，進(jìn)而調(diào)控多種生物通路。近年來(lái)m6A被認(rèn)為是宿主免疫細(xì)胞區(qū)分自身和非自身的重要機(jī)制，也可能是病毒免疫逃避的一種機(jī)制，然而m6A在先天免疫中的作用尚不清楚。

2019年4月23日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院在《Nature Communications》（IF：12.353）上發(fā)表了題為“Mettl3-mediated mRNA m6A methylation promotes dendritic cell activation” 的文章，揭示了RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Mettl3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）功能活化的分子機(jī)制。

研究方法

首先，作者利用DC模型檢測(cè)m6A修飾在DC成熟過(guò)程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)成熟DC（maDC）中m6A修飾水平及其甲基轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高（圖1.a b）。隨后在轉(zhuǎn)錄組水平，作者利用免疫沉淀聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)（meRIP-seq）分析m6A修飾，富集到高置信度的m6A峰，GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄本聚類(lèi)在免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)中（圖1.e）。

圖1. m6A修飾水平在maDC中升高

接著，作者在DC中特異性缺失Mettl3基因（Mettl3KO），研究m6A在DC成熟和功能中的作用，發(fā)現(xiàn)Mettl3基因缺失，共刺激分子表達(dá)下降，促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生受損（圖2.a-d）。

使用吉?jiǎng)P基因提供的慢病毒產(chǎn)品Lenti-Mettl3(M3-Wt)和Lenti-Mettl3分別過(guò)表達(dá)野生型Mettl3（M3_Wt）和突變型Mettl3，過(guò)表達(dá)M3_Wt可恢復(fù)正常功能，過(guò)表達(dá)突變型沒(méi)有這種效果（圖2.f、g），表明Mettl3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)DC的成熟和促炎細(xì)胞因子的分泌。

圖2. Mettl3以催化m6A的方式促進(jìn)DC成熟

此外，作者還檢測(cè)了Mettl3 KO的DC促進(jìn)T細(xì)胞增殖的情況，通過(guò)體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Mettl3的m6A催化活性是DC促進(jìn)T細(xì)胞增殖功能必需的（圖3）。

圖3. Mettl3催化m6A的方式促進(jìn)DC催化T細(xì)胞增殖

作者進(jìn)一步研究了Mettl3介導(dǎo)m6A促進(jìn)DC成熟和活化的分子機(jī)制。RNA-seq發(fā)現(xiàn)Mettl3缺失導(dǎo)致TLR4/NF-κB通路下游的分子表達(dá)下調(diào)（圖4.a、b），測(cè)量該通路分子的表達(dá)和磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)分子的表達(dá)和磷酸化水平顯著降低（圖4.e），表明基因的下調(diào)可能由轉(zhuǎn)錄活性降低導(dǎo)致。

圖4. Mettl3在DC成熟過(guò)程中增強(qiáng)先天反應(yīng)和NF-κB通路信號(hào)傳導(dǎo)

然后作者探究了Mettl3是否是通過(guò)m6A依賴(lài)機(jī)制調(diào)控Tirap、CD80、CD40的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)Mettl3KO maDC中CD40和CD80在蛋白水平、m6A修飾水平降低（圖5.a-c）。基因組核糖體分析發(fā)現(xiàn)，Mettl3KO maDC中蛋白的翻譯效率降低（圖5.d、c）。

圖5. Mettl3在體內(nèi)促進(jìn)Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻譯

同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)也得到類(lèi)似的結(jié)果（圖6），表明Mettl3介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)了Tirap、CD40、CD80的翻譯表達(dá)。

圖6. Mettl3在體外促進(jìn)Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻譯

最后，作者使用免疫沉淀反應(yīng)和基因敲除實(shí)驗(yàn)研究了m6A閱讀器Ythdf1與CD40和CD80翻譯增加的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Ythdf1可以識(shí)別m6A修飾的mRNA，促進(jìn)CD40和CD80 mRNA翻譯（圖7）。

圖7. CD40和CD80的m6A依賴(lài)性翻譯增強(qiáng)與Ythdf1呈正相關(guān)


總 結(jié)

1. Mettl3介導(dǎo)的CD40、CD80和Tirap的m6A在促進(jìn)DC活化和成熟中起重要作用；

2. CD40和CD80的上調(diào)表達(dá)有助于DC的抗原呈遞和T細(xì)胞刺激；

3. Tirap的高表達(dá)增強(qiáng)了TLR4/NF-κB信號(hào)，提高了促炎細(xì)胞因子的分泌。

吉?jiǎng)P助力

該研究中慢病毒產(chǎn)品：Lenti-Mettl3、Lenti-Mettl3及對(duì)照病毒均由吉?jiǎng)P基因提供。通過(guò)感染樹(shù)突細(xì)胞（DCs），使其有效的過(guò)表達(dá)野生型或突變型Mettl3，進(jìn)而幫助證明了Mettl3通過(guò)催化m6A修飾促進(jìn)DC的成熟和促炎細(xì)胞因子的。