RNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m6A）修飾通過影響mRNA穩定性、翻譯、轉位調控RNA代謝，進而調控多種生物通路。近年來m6A被認為是宿主免疫細胞區分自身和非自身的重要機制，也可能是病毒免疫逃避的一種機制，然而m6A在先天免疫中的作用尚不清楚。

2019年4月23日，中國醫學科學院北京協和醫學院在《Nature Communications》（IF：12.353）上發表了題為“Mettl3-mediated mRNA m6A methylation promotes dendritic cell activation” 的文章，揭示了RNA甲基化轉移酶Mettl3介導的m6A修飾促進樹突狀細胞（DC）功能活化的分子機制。

研究方法

首先，作者利用DC模型檢測m6A修飾在DC成熟過程中的表達情況，發現成熟DC（maDC）中m6A修飾水平及其甲基轉移酶水平顯著升高（圖1.a b）。隨后在轉錄組水平，作者利用免疫沉淀聯合高通量測序技術（meRIP-seq）分析m6A修飾，富集到高置信度的m6A峰，GO富集分析發現這些轉錄本聚類在免疫系統和炎癥反應中（圖1.e）。

圖1. m6A修飾水平在maDC中升高

接著，作者在DC中特異性缺失Mettl3基因（Mettl3KO），研究m6A在DC成熟和功能中的作用，發現Mettl3基因缺失，共刺激分子表達下降，促炎細胞因子的產生受損（圖2.a-d）。

使用吉凱基因提供的慢病毒產品Lenti-Mettl3(M3-Wt)和Lenti-Mettl3分別過表達野生型Mettl3（M3_Wt）和突變型Mettl3，過表達M3_Wt可恢復正常功能，過表達突變型沒有這種效果（圖2.f、g），表明Mettl3介導的m6A修飾促進DC的成熟和促炎細胞因子的分泌。

圖2. Mettl3以催化m6A的方式促進DC成熟

此外，作者還檢測了Mettl3 KO的DC促進T細胞增殖的情況，通過體外和體內實驗發現Mettl3的m6A催化活性是DC促進T細胞增殖功能必需的（圖3）。

圖3. Mettl3催化m6A的方式促進DC催化T細胞增殖

作者進一步研究了Mettl3介導m6A促進DC成熟和活化的分子機制。RNA-seq發現Mettl3缺失導致TLR4/NF-κB通路下游的分子表達下調（圖4.a、b），測量該通路分子的表達和磷酸化水平，發現分子的表達和磷酸化水平顯著降低（圖4.e），表明基因的下調可能由轉錄活性降低導致。

圖4. Mettl3在DC成熟過程中增強先天反應和NF-κB通路信號傳導

然后作者探究了Mettl3是否是通過m6A依賴機制調控Tirap、CD80、CD40的表達。發現Mettl3KO maDC中CD40和CD80在蛋白水平、m6A修飾水平降低（圖5.a-c）?；蚪M核糖體分析發現，Mettl3KO maDC中蛋白的翻譯效率降低（圖5.d、c）。

圖5. Mettl3在體內促進Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻譯

同時，體外實驗也得到類似的結果（圖6），表明Mettl3介導的m6A修飾促進了Tirap、CD40、CD80的翻譯表達。

圖6. Mettl3在體外促進Tirap、CD80和CD40 mRNA的翻譯

最后，作者使用免疫沉淀反應和基因敲除實驗研究了m6A閱讀器Ythdf1與CD40和CD80翻譯增加的關系，發現Ythdf1可以識別m6A修飾的mRNA，促進CD40和CD80 mRNA翻譯（圖7）。

圖7. CD40和CD80的m6A依賴性翻譯增強與Ythdf1呈正相關


總 結

1. Mettl3介導的CD40、CD80和Tirap的m6A在促進DC活化和成熟中起重要作用；

2. CD40和CD80的上調表達有助于DC的抗原呈遞和T細胞刺激；

3. Tirap的高表達增強了TLR4/NF-κB信號，提高了促炎細胞因子的分泌。

吉凱助力

該研究中慢病毒產品：Lenti-Mettl3、Lenti-Mettl3及對照病毒均由吉凱基因提供。通過感染樹突細胞（DCs），使其有效的過表達野生型或突變型Mettl3，進而幫助證明了Mettl3通過催化m6A修飾促進DC的成熟和促炎細胞因子的。