01 PCR產(chǎn)物的純化是獲得高質(zhì)量模板的核心
Sanger測(cè)序是一個(gè)高度精確的技術(shù)，可以逐個(gè)堿基讀出 DNA 序列，對(duì)模板的純凈度有著極高的要求。然而，PCR產(chǎn)物中的游離引物和核苷酸往往會(huì)干擾測(cè)序結(jié)果。如何在不損耗珍貴樣本的前提下，獲取干凈、高質(zhì)量的模板，是一個(gè)急需解決的難題。
圖1.Sanger測(cè)序原理
在這種情況下，PCR產(chǎn)物的純化成為了眾多科研工作者的首選策略。傳統(tǒng)的PCR純化方法，如乙醇醋酸鈉純化、磁珠純化或柱純化，雖然有效，但往往耗時(shí)耗力，且在操作過程中容易損失樣本。對(duì)于樣本量有限的研究者來(lái)說(shuō)，這無(wú)疑是一個(gè)相當(dāng)棘手的問題。
翌圣生物提供的酶法PCR純化法有著非常簡(jiǎn)單直接的工作流程，只有一個(gè)移液步驟。只需將核酸外切酶（Exonuclease I）和堿性磷酸酶加入PCR產(chǎn)物中，并在37℃靜置15~30 min，即可完成純化。這種方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且大大減少了樣本的損失，特別適合樣本量有限的研究。
02 PCR酶法純化是如何降解游離的引物和核苷酸，而不影響dsDNA目的產(chǎn)物
關(guān)鍵在于Exonuclease I！
Exonuclease I是一種對(duì)變性或單鏈脫氧核糖核酸具有高度選擇性的核酸外切酶，作用時(shí)，Exonuclease I從引物（單鏈聚脫氧核糖核苷酸）的3 羥基端開始攻擊，隨后逐步釋放出脫氧核糖核苷5 ' -單磷酸鹽，但末端二核苷酸會(huì)保持完整。Exonuclease I對(duì)雙鏈DNA或RNA無(wú)活性，因此不會(huì)降解目標(biāo)產(chǎn)物dsDNA。接著，堿性磷酸酶將反應(yīng)體系中的核苷酸去磷酸化，去磷酸化意味著反應(yīng)體系中dNTP失去活性，從而不會(huì)影響測(cè)序反應(yīng)。這是因?yàn)闇y(cè)序反應(yīng)體系中的dNTP:ddNTP需要遵循特定比例，任何比例的偏差都可能引起不可預(yù)測(cè)的測(cè)序結(jié)果。（點(diǎn)擊鏈接，獲取更多Exonuclease I產(chǎn)品詳情）
圖2.Exonuclease I反應(yīng)原理
03 PCR酶法純化會(huì)影響后續(xù)的測(cè)序嗎？
答案是：不會(huì)！
只需將反應(yīng)混合物加熱至80℃并保持15 min，即可使酶失活，得到干凈的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，直接用于測(cè)序反應(yīng)。整個(gè)過程快速高效，無(wú)需額外的純化步驟，也不會(huì)造成樣本的損失。
翌圣PCR產(chǎn)物純化解決方案
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號(hào) |
規(guī)格 |
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Exonuclease I(20 U/μL) |
1000 U/5000 U |
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Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (1 U/µL) |
250 U |