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?? 總的說來，熒光檢測(cè)技術(shù)可大致分為兩大類：通用型的熒光染料檢測(cè)法和高特異性的熒光探針法。前者主要是利用熒光染料(如SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點(diǎn)是：無需另外設(shè)計(jì)熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡(jiǎn)便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀，缺點(diǎn)是專一性不如探針法；而后者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來識(shí)別模版，優(yōu)點(diǎn)是特異性更高，適用于擴(kuò)增序列專一檢測(cè)(見下表)，不過增加了熒光探針的成本。

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?? 除了以上這些，還有雙探針系統(tǒng)(bi-probe system)、BODIPY FL標(biāo)記探針、Light- up探針、iFRET(induced fluorescence resonance energy transfer) 技術(shù)、Qzyme 探針和Magiprobe等等。

這么多種熒光標(biāo)記方法，在選擇的時(shí)候當(dāng)然要根據(jù)各人實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)要求，還有經(jīng)費(fèi)來判斷了。

熒光染料

?? 對(duì)于專一性要求不高的實(shí)驗(yàn)，或者是大規(guī)模高通量的實(shí)驗(yàn)，使用方便、花費(fèi)較小的熒光染料可以作為你初步的選擇對(duì)象。老實(shí)說，熒光染料法實(shí)質(zhì)上無非就是常規(guī)的PCR反應(yīng)中添加了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結(jié)合所發(fā)出的熒光實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)的進(jìn)程。由于不需要設(shè)計(jì)序列特異性探針和優(yōu)化反應(yīng)條件，價(jià)格低廉，通用性強(qiáng)，而且熒光染料法可用于任何一種型號(hào)的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。熒光染料法的專一性和PCR沒有本質(zhì)的區(qū)別---但是作為“失之毫厘，謬之千里”高度精確的實(shí)驗(yàn)，你依然可以選擇更好的熒光染料、更嚴(yán)謹(jǐn)專一的PCR酶、更好的緩沖體系來提高反應(yīng)的可靠程度。

?? 在熒光染料法的定量PCR反應(yīng)試劑中，最常用的是SYBR Green I，這種高靈敏度，較低毒性的核酸染料最大激發(fā)波長(zhǎng)497nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是520nm，在結(jié)合雙鏈DNA分子后熒光增強(qiáng)800-1000倍，靈敏度較EB更高，毒性較EB低，可避免EB對(duì)于小分子量DNA靈敏度較低，而在監(jiān)測(cè)大分子量DNA區(qū)域可能會(huì)出現(xiàn)背景色等等弱點(diǎn)，因此經(jīng)過時(shí)間的篩選漸漸成為了定量PCR熒光染料的“當(dāng)家花旦”。

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)；當(dāng)DNA變性時(shí)SYBR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，經(jīng)檢測(cè)獲得熒光的凈增量。熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

?? 熒光染料可以在反應(yīng)末尾對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點(diǎn)緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點(diǎn)，定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測(cè)每個(gè)樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長(zhǎng)度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)在不同的溫度點(diǎn)解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測(cè)量。對(duì)溶解曲線進(jìn)行微分可以計(jì)算出溶解峰。溶解峰可以反映反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線數(shù)據(jù)就可以進(jìn)行定量監(jiān)督了。

SYBR的主要優(yōu)勢(shì)：

?? 安全性：SYBR染料的致突變性遠(yuǎn)低于EB數(shù)倍甚至數(shù)十倍(取決于不同受檢物種或株系)

超高靈敏度：具有1000倍以上的熒光增強(qiáng)效果和0.6的量子產(chǎn)量；與此相比，EB只有大約30倍的熒光增強(qiáng)效果和0.15的量子產(chǎn)量。因此，SYBR Gold檢測(cè)核酸的靈敏度是EB的十倍以上。(這主要是因?yàn)?/SPAN>SYBRGreen是和DNA小溝結(jié)合，而EB則是嵌入到堿基之間)

使用電泳后染色程序可提高靈敏度，而滲透入凝膠的速度極快。

通用性：可在各種類型的凝膠如高濃度瓊脂糖、乙二醛瓊脂糖、甲酰胺瓊脂糖、聚丙烯酰胺和尿素-聚丙烯酰胺凝膠中檢測(cè)雙鏈DNA。

?? 簡(jiǎn)便易用：只須將凝膠在染色液中保溫10-40分鐘(取決于凝膠的厚度和濃度)，無須脫色，背景極低。

?? 與其他分子生物學(xué)技術(shù)兼容：對(duì)酶切、連接和PCR反應(yīng)都沒有影響。