題目：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5
期刊：Biochemical and Biophysical Research Communications
影響因子：2.466
主要技術(shù)：EMSA
研究背景
脂肪酶（Lipase）是一種存在于動(dòng)物、植物、微生物中的工業(yè)用酶，廣泛應(yīng)用于食品、去垢劑、生物質(zhì)能等領(lǐng)域。目前商品化的脂肪酶主要來源于微生物，但傳統(tǒng)的育種、培養(yǎng)基營養(yǎng)優(yōu)化的手段在提高其產(chǎn)量方面面臨瓶頸，亟待從分子機(jī)制層面尋找解決途徑。目前研究證實(shí)細(xì)菌中脂肪酶的表達(dá)受到雙組份調(diào)控體系如LipQ-LipR的調(diào)節(jié)，但假單胞菌P. protegens Pf-5菌株的分子調(diào)控機(jī)制有待深入研究， AlgR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在假單胞菌P. protegens Pf-5菌株中對于脂肪酶產(chǎn)量控制關(guān)系及機(jī)理此前還未見報(bào)道，同時(shí)已知AlgR也能夠調(diào)節(jié)ncRNA RsmZ，故而本文采取基因敲除、lacZ報(bào)告基因、EMSA等方法研究AlgR對于lipA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. 證實(shí)AlgR在轉(zhuǎn)錄水平控制lipA表達(dá)
構(gòu)建了algR敲除的Pf-5菌株（名為Pf6003），培養(yǎng)測定其生長曲線，并檢測對比敲除菌株中lipA酶活性。結(jié)果顯示野生型、algR敲除型Pf-5菌株的呈現(xiàn)一致生長曲線，說明algR的敲除不影響Pf-5的生長（圖A），但是敲除株的總脂肪酶活性顯著下降（圖B）。
此外將lipA的啟動(dòng)子連接lacZ報(bào)告基因、將報(bào)告基因質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入野生型及突變型Pf-5菌株，后續(xù)檢測β半乳糖苷酶（b-galactosidase）活性，發(fā)現(xiàn)在敲除突變株中b半乳糖苷酶活性低于野生型（圖C）。通過RT-PCR檢測lipA的mRNA表達(dá)，顯示突變株中lipA mRNA水平降低（圖D）。
同時(shí)通過lacZ報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示algR的補(bǔ)償過表達(dá)在野生型和缺失突變型Pf-5中都能提高β半乳糖苷酶活性及lipA酶活性。
2. AlgR影響rsmX/rsmY/rsmZ的表達(dá)
使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)在Pf-5菌株中敲除AlgR基因后，rsmX/rsmY/rsmZ的轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。
3. AlgR直接結(jié)合于rsmZ啟動(dòng)子序列
本文表達(dá)純化了AlgR蛋白、合成了rsmX/rsmY/rsmZ啟動(dòng)子序列的探針，進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AlgR蛋白同這些基因啟動(dòng)子序列的互作關(guān)系，證實(shí)AlgR蛋白存在直接相互作用、而AlgR蛋白不能結(jié)合于rsmX/rsmY的啟動(dòng)子序列。
4. AlgR通過rsmZ調(diào)節(jié)lipA的表達(dá)
構(gòu)建了rsmZ敲除的Pf-5菌株（名為Pf6285），并構(gòu)建了同時(shí)雙敲除algR和rsmZ的Pf-5菌株（名為Pf6100），通過lazZ報(bào)告基因及酶活力測定顯示，同時(shí)敲除algR和rsmZ基因的Pf6100中lipA表達(dá)及總酶活性顯著低于algR單獨(dú)敲除的菌株，而在algR單獨(dú)敲除株中過表達(dá)rsmZ能夠使lipA酶表達(dá)及活性恢復(fù)到野生型水平。
文章小結(jié)
本文構(gòu)建了分別單獨(dú)敲除algR或rsmZ的假單胞菌株Pf-5，以及同時(shí)敲除algR和rsmZ的菌株，通過lacZ報(bào)告基因系統(tǒng)以及細(xì)胞總酶活力測定，證實(shí)了algR的缺失突變導(dǎo)致lipA水平下降，同時(shí)rsmZ的過表達(dá)能夠補(bǔ)償algR缺失對于lipA的下調(diào)效應(yīng)，并通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了AlgR蛋白能直接結(jié)合于rsmZ的啟動(dòng)子序列，說明algR基因是通過rsmZ來調(diào)控假單胞菌株Pf-5中lipA的表達(dá)水平。
解析文獻(xiàn)
Menggang Li, Jinyong Yan, Yunjun Yan. The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487(2017)173-180.
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