作者：DJ孟

說到基因編輯，一定離不開CRISPR/Cas9技術，起初它是細菌應對病毒感染或外源質粒入侵產生的免疫防御系統。當病毒入侵時，細菌將外源遺傳物質整合插入到宿主的CRISPR位點中。當病毒再次感染時，CRISPR轉錄的crRNA/tracrRNA結合Cas9蛋白，切割外源DNA序列達到免疫目的。

因此，CRISPR/Cas9也漸漸用于基因的敲除。隨著對CRISPR/Cas9的深入研究，衍生出很多Cas9工具，下面簡單介紹一下各種Cas9工具的應用。

CRISPR/Cas9包含Cas9蛋白和sgRNA（crRNA和tracrRNA）兩部分。其中，crRNA部分序列能夠與tracrRNA互補，tracrRNA能夠形成莖環結構與Cas9蛋白結合，之后Cas9/crRNA復合物開始識別基因組的PAM序列（5’-NGG），DNA雙鏈解旋，crRNA與基因組鏈雜交引導Cas9蛋白定位，最終由Cas9蛋白的HNH核酸酶結構域剪切互補鏈，RuvCI結構域剪切非互補鏈，產生DNA雙鏈斷裂(DSB)。

Cas9蛋白的RuvC結構域分為三個亞結構域：RuvC I、RuvC II和RuvC III，RuvC I位于Cas9氨基端，RuvC II和RuvC III位于HNH結構域兩側。RuvC I突變(D10A)能得到Cas9切口酶(Cas9 nickase, Cas9n)，它僅能切割與crRNA互補的DNA鏈；當同時突變Cas9的兩個結構域(D10A，H840A)，可以得到只有DNA結合活性但沒有切割活性的dCas9蛋白。

起初，CRISPR/Cas9技術僅用于基因的敲除。當敲除編碼基因時（KO），sgRNA靶序列要設計在基因的外顯子區，盡量靠近編碼區上游。對于含有多個轉錄本的編碼基因，靶序列應設計在同源區，Cas9蛋白切割基因組后，通過非同源末端連接(NHEJ)產生移碼突變，達到基因敲除的目的。如果要敲除miRNA，靶序列要放在miRNA成熟體上或莖環處。而針對lncRNA敲除，要在基因上下游設計兩對sgRNA，將整個lncRNA序列從基因組切掉（lncRNA敲除方法和效率可參考）。

CRISPR/Cas9不僅能敲除基因，而且還能敲入基因（knock in）。它先利用Cas9蛋白在目的基因特定位置切割，然后以含待敲入序列的donor質粒為模板，通過同源修復(HDR)方式，引入點突變或者外源基因。常見的敲入基因如：在基因的N端或者C端插入GFP/Flag/Luciferase等序列監測內源基因的定位、表達和示蹤，或者結合Cre-LoxP系統引入序列實現組織特異性點突變。

基因的敲除和敲入需要Cas9蛋白切割基因組才能進行基因編輯，但是某些調控基因表達的方式用不到Cas9核酸酶切割活性，只是用到Cas9蛋白結合DNA的特性，這就需要利用到失去核酸酶切割活性的dCas9蛋白（D10A，H840A）。

CRISPRi是除RNAi之外另一種抑制基因轉錄的方式。它是將sgRNA靶序列設計在基因的TSS附近，dCas9蛋白在sgRNA引導下結合在基因的啟動子區，最終由于空間位阻效應抑制目的基因轉錄。如果想要增強這種抑制作用，可以將dCas9蛋白和轉錄阻遏結構域（KRAB）融合，從而更加高效地抑制轉錄。當然，CRISPRi僅限那些鄰近區域沒有其他基因的基因進行特異性沉默（具體參考 ）。

同樣地，dCas9也可以與轉錄激活因子融合，靶向基因的啟動子和增強子區激活基因的內源性表達（CRISPRa）。激活結構域可以是單個或者多個因子融合，dcas9-多融合體如VPR（VP64、P65和Rta5）的激活效率遠比融合單個VP64的激活效率高。

此外，還可以利用Cas9 SAM系統，將sgRNA融合MS2發夾招募MS2-P65-HSF1到dCas9-VP64蛋白上，激活基因的內源表達。CRISPRa方法一般適用于不能直接外源過表達的大基因。

基因的表觀遺傳修飾如甲基化，雖然不改變基因的核苷酸序列，但能產生可遺傳的變異。這種系統也需要利用dCas9融合如DNA甲基化酶（Dnmt3a）或去甲基化酶（Tet1CD），由sgRNA序列將dcas9-酶復合物引導至特定位點進行甲基化或者去甲基化修飾，從而影響基因的表達。

綜上可知，CRISPR/Cas9技術具有很大的應用空間，它不僅限于敲除目的基因，CRISPR/Cas9也在基因的轉錄激活和抑制及特定位點的遺傳修飾中得到了廣泛應用。