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NGS接頭集中營，如何選擇看這里！

接頭是一段序列已知的短核苷酸序列，與目標核酸片段兩端連接，測序時與測序芯片上的已知序列進行雜交，從而將文庫結合到芯片上，進而啟動測序。隨著測序技術的發展，接頭種類越來越多，比如單端/雙端接頭、UMI接頭、轉座酶接頭、完整/不完整接頭等等，適配于多種應用場景。下面一起系統地梳理下這些接頭，看看該如何選擇!

接頭結構介紹

●P5和P7端：illumina平臺中，與測序芯片上的P5和P7端結合，將待測文庫固定到測序芯片上，以便于通過橋式PCR進行成簇反應；

●Rd1 SP和Rd2 SP：測序引物結合的區域，指示序列開始讀取的位置；

●Index：用于區分不同樣本的一段已知的合成序列

圖1. Illumina平臺單端index 文庫示意圖

圖2. MGI平臺單端index文庫示意圖

Index/Barcode的作用

Index也稱Barcode，隨著測序通量的提升，可實現多個樣本同時測序，因此就在接頭中引入了index或Barcode的序列以區分不同的樣本。 Index長度一般為6nt-18nt的已知合成序列，根據index的數目分為單端index和雙端index，雙端index分別位于待測片段的兩端。在選擇index組合的時候需要考慮到堿基平衡和熒光平衡。

堿基平衡，指的是Index的復雜度和平衡度，是多個Index之間的平衡，而非單個Index內部的堿基平衡，需要從堿基種類和堿基分布兩個方面考慮，組合的原則是：同一組index中的A/T/C/G四種堿基都需要包含，且這4種堿基的比例接近，各占25%左右。

熒光信號平衡，是指在不能保證堿基平衡的情況下，選擇保證熒光信號的平衡。在Illumina平臺中的4通道測序儀中，dG/dT使用綠色熒光標記，dC/dA使用紅色熒光標記。測序時每個循環里綠色和紅色兩種熒光信號都必須存在以保證測序順利進行。因此在選擇Index時需要考慮綠色信號和紅色信號的平衡。

● 雙端index之UDI&UDB：減少index hopping和misassignment的好幫手

Unique Dual Index&Unique Dual Barcode，雙端唯一index，兩端index一一對應，成組設計，兩端可交叉驗證；

● 雙端index之CDI：Combined Dual Index，一對多的接頭，即可以根據一定的要求對兩端的index進行組合，最終形成的是雙端index文庫；

Illumina為了進一步提升通量與擴增效率，降低測序成本，為Novaseq等高通量型測序儀引入了陣列式流動槽（PFCT）和排他性擴增（ExAmp）成簇技術，但無意間卻放大了Index hopping的樣本標簽錯配現象。

圖3. Illumina不同儀器型號采取Non-patterned Flow Cell或Patterned Flow Cell模式圖

為了彌補HiSeq3000/4000、HiSeq X Series及NovaSeq等測序平臺凸顯的標簽跳躍問題，Illumina提出在文庫的兩端都帶上獨特標簽（UDI）的策略，可以進行雙側校驗，剔除標簽錯配的接頭。采用雙端唯一index分析數據時，可以將index錯誤分配率降低到0.01%，與之前常規的index排列組組合方法對比，Index hopping降低了兩個數量級。

在PCR-free的文庫構建中，可選擇單端index接頭，其標簽錯配主要是由于測序錯誤錯誤引起，整體而言，標簽錯配率較低（平均為 0.0004%，最高至 0.001%）；但在靶向捕獲文庫構建中，由于多個步驟都會導致標簽錯配，因此串擾問題則被放大，通常會采用UDI/UDB的接頭。

UMI接頭：低頻突變檢測、絕對定量的利器

Unique molecular identifier，單一分子標簽，是一段序列已知的隨機合成序列，可以設計為完全隨機的核苷酸鏈、部分簡并核苷酸鏈或者固定核苷酸鏈，長度通常為10nt（單端UMI）或5-8nt（雙端UMI）。其作用是凍結DN**段擴增前的狀態，每個DNA分子對應一個UMI，因此生信分析時可以區分不同來源的DNA模板，分辨哪些是PCR擴增及測序過程中的隨機錯誤造成的假陽性突變，哪些是患者真正攜帶的突變，從而過濾掉背景噪音，實現低頻和極低頻突變的準確檢測，對不同DNA分子進行絕對定量等。廣泛應用于低頻突變檢測，尤其是在腫瘤的研究領域中。

圖4. illumina平臺UMI接頭結構示意圖

完整接頭&不完整接頭&Tn5接頭

除Tn5接頭外，接頭通常以TA連接的方式與目的片段連接。按照有無完整的P5端和P7端（Illumina平臺）分為完整接頭和不完整接頭：

●完整接頭：PCR-free文庫構建的必備產品

完整接頭包含測序時所需要的全部序列，如在Illumina平臺中有P5端、P7端、RdS1及RdS2，同時根據建庫測序要求包括Index序列、UMI序列等，可不進行PCR反應引入其它接頭成分而直接上機測序，可用于構建PCR-Free的文庫，PCR-free文庫可以減少PCR擴增偏好性、錯誤率以及序列重復，提高一些高GC或者高AT區域的覆蓋度，在群體基因組研究中應廣泛。

圖5. 完整接頭示意圖

●不完整的接頭

不完整接頭需要在接頭連接反應后，通過PCR的方式加上其它部分序列，以形成一個完整的接頭，也就是說不完整接頭最終一定要通過PCR擴增形式形成完整接頭才能上機測序，PCR的過程一方面是是對完整文庫的一個富集作用，保證有效文庫的濃度，同時還可以引入雙端index和UMI序列；

●Tn5接頭：片段化與接頭連接同步進行，省時省樣本

Tn5接頭是通過Tn5的限制性內切酶活性，在識別并切割雙鏈DNA時，將接頭的部分序列連接到DN**段兩端，最后經過PCR的方式引入其余部分序列以及index、UMI等序列，最后形成完成的文庫?？捎糜贑UT&Tag文庫構建。

圖6. Tn5接頭文庫構建示意圖

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