體積很小，很少影響蛋白功能

V5

GKPIPNPLLGLDST

1.4

親和、純化

適用于基于抗體的純化

GST

Large Protein

26

純化、穩定蛋白

適用于谷胱甘肽純化； 防止蛋白水解，但可能降低溶解度

三、熒光蛋白標記

關于熒光蛋白，前面有文章專門進行過介紹-選擇最好的熒光蛋白-Light Up Your Research。文章中介紹了熒光蛋白的應用及選擇熒光蛋白需要考慮的問題。對于細胞實驗，載體上帶有一個熒光蛋白可以很方便的觀察細胞的轉染效率，在選擇熒光蛋白進行實驗時，在前面文章的基礎上補充如下幾點：

1、 選擇哪種熒光蛋白，可以結合后續的實驗方案判斷，比如后續實驗是否需要進行免疫熒光WB，如有，那要避開相同顏色的熒光蛋白，好在目前有很多不同顏色的熒光蛋白和標記不同顏色的抗體可以選擇

2、 相同細胞是否會同時轉染不同病毒，如果會，那兩個病毒需要帶有不同的熒光蛋白，方便觀察每種病毒的感染效率

3、 是否需要示蹤定位目的基因的表達，如果需要目的基因與熒光蛋白融合表達，可以放在目的基因的N端，也可以放在目的基因的C端，放在哪里可以根據目的基因蛋白的功能決定，類似標簽的位置。這樣的構建方式可以幫助我們觀察到目的基因是什么時候開始表達以及在哪里表達。如果不需要示蹤定位目的基因，那可以考慮非融合表達，非融合表達有如下三種方式：

（1） 單獨啟動子啟動，如SV40-EGFP，CMV-ZsGreen1，或者EF1a-copGFP，這種結構理論上不會影響目的基因蛋白的功能。

（2） "self-cleaving" 2A結構，這里“自我切割”并不完全準確，因為這些肽被認為是通過使核糖體跳過2A元件C端的肽鍵合成而起作用的，從而導致2A序列末端之間的分離。“切割”發生在2A 序列C端的甘氨酸和脯氨酸殘基之間，這意味著上游基因將在末端添加一些額外的殘基，而下游基因將以脯氨酸開始。2A切割在真核細胞中是普遍的存在的，盡管一些科學家報告說其中的某些肽接近100％切割，但尚未就哪種肽效果最佳達成共識。特定2A肽的選擇可能最終取決于許多因素，例如細胞類型或實驗條件。常見的2A如下，前面增加的GSG三個氨基酸有利于增加2A的切割效率。

（3） IRES結構，IRES元件非常有用，通常在雙順反子載體中應用最多。但是其缺點是元件非常大（500-600 bp），可能會在包裝能力有限的病毒轉移載體中占據寶貴的空間。同時使用IRES元件一次表達兩個以上的基因可能是不可行的。此外，科學家報告了IRES下游基因的表達較低，可能原因是由于細胞類型和特定基因等因素引起的。也有文獻報告，IRES前面的基因大小不要超過1.5k，有利于后面基因的表達效率。

四、真核抗性篩選標記

真核抗性篩選標記通常在慢病毒載體中使用最多，原因是慢病毒能夠整合到基因組中，此時如果慢病毒載體帶有有個篩選篩選標記，那會很方便的獲得穩定細胞系。穩定轉染的細胞可以被認為是與原始親代細胞完全不同的細胞系。在選擇使用哪種標記的載體需要考慮如下幾點：

1、 相同細胞是否會同時轉染不同病毒，如果會，那兩個病毒需要帶有不同的真核抗性篩選標記，方便后面感染效率的判斷或者穩定細胞系的篩選

2、 哺乳動物細胞中沒有一種推薦的濃度可供選擇。在進行感染實驗之前，需要確定所需的有效篩選的抗性濃度。合適的抗性濃度一般會使細胞在3-5天內死亡，抗性細胞會在10-14天內出現，具體取決于細胞分裂的速度及細胞對抗性的耐受程度。

3、 慶大霉素通常在哺乳動物細胞培養中用來抑制細菌生長，不適用于哺乳動物細胞的選擇-請勿將其與G418（又名遺傳霉素）混淆。

4、 新霉素不應用于哺乳動物表達，而應使用G418。 由于neo / kan基因賦予G418抗性，這可能會造成混淆。

常見的真核抗性篩選標記如下:

基因遞送方式通常有這么兩種：（1）通過非病毒基因轉移技術使用化學和物理方法將DNA傳遞到細胞中；（2）通過病毒基因轉移技術使用病毒載體將基因轉移到細胞中。特別是第二種方法，在基因治療中使用尤為廣泛，越來越多的病毒載體用于到基因治療中，我們常見的有慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關病毒載體等等。關于選擇何種載體，我們吉凱基因前期舉辦過專門的在線課程-熱門“工具病毒”載體的選擇與應用指南，感興趣的老師可以點回看。我們知道一個載體通常都由自己的啟動子，標簽,熒光蛋白標記，真核抗性篩選標記等這些元件組成，而且每種元件都會有不同的連接方式，那今天小編就簡單介紹如何選擇這些元件，希望通過這篇文章能夠幫助您選擇合適，正確的載體。

一、啟動子

啟動子通常分為三類：組成型/廣譜啟動子，組織/細胞基因特異性啟動子，誘導表達啟動子。

1、 組成型/廣譜啟動子：組成型啟動子是在組成型啟動子的調控下，不同組織器官和發育階段的基因表達沒有明顯差異。組成型啟動子的調控不受外界條件的影響，所啟動基因的表達具有持續性，但不表現時空特異性，亦稱之為非特異性表達啟動子。常見組成型啟動子如下：

2、 組織/細胞基因特異性啟動子：亦稱之為器官特異性啟動子，是指在該啟動子調控下，外源基因的表達一般只發生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現出發育調節的特性。其最大的優點是它所啟動的外源基因在受體中僅在需要的部位特異表達，從而克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體中非特異、持續、高效表達所造成的浪費，增加轉基因的效果。特別在腺相關病毒載體中，特異性啟動子應用尤為廣泛，吉凱基因部分特異性啟動子列表：