編者按

 轉化生長因子β（TGF-β）是分泌型二聚體細胞因子多功能家族的原型成員，TGF-β信號通路的每一步都受到精確控制，并與其他信號通路串擾。上皮-間充質轉化（EMT）是一種動態且可逆的形態過程，是胚胎發育[1]（Nakajima等人，2000）和傷口愈合[2]（Barriere等人，2015）過程中的瞬時和可逆的關鍵過程。此外，它在病理過程中起著重要作用，特別是在癌癥進展和纖維化中[3-4]（Zeisberg等人，2007;Derynck&Weinberg，2019年）。TGF-β是EMT的有效誘導劑[5]（Derynck等人，2014）。鞘糖脂（GSL）是在細胞膜中發現的主要一類糖脂。

今天，我們特別關注一項2022年12月由荷蘭萊頓大學醫學中心蛋白質組學和代謝組學中心研究團隊在EMBO J（IF=11.4）上發表的研究成果，該研究構建了斑馬魚異種移植模型，并利用小鼠正常乳腺上皮NMuMG細胞和人肺上皮腺癌A549細胞，通過分析糖組學平臺研究GSLs在TGF-β誘導的EMT中的改變和作用，結果表明，通過失活糖基轉移酶UGCG來抑制GSL表達可促進TGF-β信號傳導和TGF-β誘導的EMT；在TGF誘導的EMT期間，這兩種細胞系中的GSLsβ顯著降低，催化A系列神經節苷脂合成的ST3GAL5抑制了TGF-β信號轉導反應。這些神經節苷脂被發現可以確定TβRI在脂筏中的定位并控制其泛素化和周轉。值得注意的是，研究者發現ST3GAL5在肺癌組織中的表達水平遠低于在鄰近正常組織中的表達水平，并且其表達與肺癌患者的良好預后相關。

文章題目

ST3GAL5‐catalyzed gangliosides inhibit TGF‐β‐induced epithelial‐mesenchymal transition via TβRI degradation

雜志：EMBO JOURNALEMBO J（IF=11.4）

發表時間：2022.12.12

作者：Jing Zhang, Tao Zhang, Peter ten Dijke等

單位：荷蘭萊頓大學醫學中心蛋白質組學和代謝組學中心等

01、研究結果

1. TGF‐β抑制NMuMG和A549‐VIM-RFP細胞中神經節苷脂的表達

為了研究TGF-β誘導的接受EMT的細胞中GSL-聚糖的變化，研究者們選擇了兩種具有顯著TGF-β誘導的EMT反應的成熟細胞模型，即NMuMG（Zhang等人，2020a）和A549-波形蛋白（VIM）-紅色熒光蛋白（RFP）細胞系（Wang等人，2020）。

結果顯示，在TGF-β刺激的A549-VIM-RFP細胞中觀察到GSLs的絕對豐度大幅下降，用TGF-β刺激NMuMG和A549-VIM-RFP細胞可顯著降低ST3GAL5蛋白表達。此外，TGF-β降低了NMuMG細胞中B4galnt1、B5galt6和St3gal5的基因表達水平，這些必需酶催化神經節苷脂的形成。

圖1

2. UGCG敲除導致NMuMG細胞中TGF-β信號轉導和TGF-β誘導的EMT的增強

糖基轉移酶UGCG是啟動復雜GSL結構合成途徑的第一種酶，為了研究GSLs在TGF-β信號傳導中的作用，研究者通過基因編輯生成UgcgNMuMG敲除（KO）細胞，進行UGCG酶活性測定、CTB和FACS分析、糖組分析和單個GSL絕對豐度的定量分析、RNA測序（RNA-seq）、基因集富集分析（GSEA）證實了UGCG介導TGF-β信號傳導抑制的假設。

隨后，研究者檢查了Ugcg耗竭對NMuMG細胞中TGF-β誘導的反應和EMT標志物表達水平的影響。結果進一步驗證了TGF-β誘導EMT增強。EMT的激活可以使細胞遷移能力增強。因此，研究者進一步研究了NMuMG細胞中UgcgKO的基礎遷移率。與對照細胞相比，具有Ugcg耗竭的NMuMG細胞顯示出遷移增強。綜上所述，UGCG是NMuMG細胞中TGF-β/SMAD信號轉導和EMT的關鍵抑制劑。

圖2

圖3

3. Eliglustat是一種UGCG活性抑制劑，可促進TGF-β信號傳導、TGFβ誘導的EMT、細胞遷移、外滲和早期轉移性生長

研究者們通過通過使用FACS分析測量GM1表達來證實eliglustat作為UGCG抑制劑的有效性；qRT-PCR分析證實，eliglustat通過增加TGF-β靶基因（包括SMAD7、SERPINE1和CCN2）的表達水平來促進TGF-β信號轉導；通過RFP標記的波形蛋白表達的動態增加和F-肌動蛋白形成的增強，進一步證實了eliglustat介導的TGF-β誘導的EMT的促進；通過劃痕測定證明eliglustat處理增強了基礎和TGF-β誘導的細胞遷移。

此外，添加SB505124完全阻斷了eliglustat誘導的細胞遷移促進，表明eliglustat誘導的細胞遷移需要TβRI信號傳導?；诖耍芯空呤褂冒唏R魚異種移植模型系統研究了eliglustat對A549細胞外滲的影響；通過尾靜脈將A549-Luc細胞注射到裸鼠體內，研究了eliglustat對A549-Luc細胞轉移能力的影響。數據表明，UGCG和UGCG定義的GSL抑制小鼠上皮NMuMG細胞和人肺癌A549細胞中的TGF-β信號傳導和EMT，以及A549細胞的遷移、外滲和轉移。

圖4

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4. 抑制GSL生物合成可降低TβRI在脂筏中的定位，保護TβRI免受泛素化并增加其穩定性

鞘糖脂被發現可以通過促進脂筏或小窩膜中膜錨定分子之間的橫向相互作用來影響信號轉導，為研究GSLs控制TGF-β受體信號轉導和TGF-β-receptor誘導的EMT機制，研究者通過免疫印跡分析，專門檢查細胞表面TβRI池，可觀察到用eliglustat處理的A549-VIM-RFP細胞中的細胞表面TβRI水平顯著增加。因此，研究者研究了抑制GSL合成是否會影響TβRI在質膜中脂筏和非脂筏微結構域之間的分配，結果顯示GSL生物合成減少會降低脂筏組分中的TβRI水平。

此外，研究者研究了eliglustat對TβRI泛素化的影響、eliglustat在調節TβRI穩定性中的作用，這些結果表明，從機制上講，GSL誘導的TGF-β信號轉導抑制是由于有利于TβRI在脂筏中的定位而引起的，從而觸發其泛素化和隨后的降解。

圖6

5. ST3GAL5介導的A系列神經節苷脂生物合成抑制TGFβ信號傳導和TGFβ誘導的EMT

使用PGCnano-LC-ESI-MS/MS對缺乏ST3GAL5或B4GALNT1的細胞進行糖組分析證實了這兩種酶產生的特定神經節苷脂產物的大幅減少。ST3GAL5敲低細胞的GM3、GM2和GM1a顯著降低，與TGF-β處理后的結果一致。然而，B4GALNT1敲除導致總GSL水平與TGF-β對神經節苷脂水平的影響非常不同。

接下來，研究者研究了ST3GAL5和B4GALNT1敲低對A549細胞中TGF-β信號傳導和EMT的影響。結果證明ST3GAL5的異位表達通過下調TGF-β誘導的SMAD2磷酸化和SMAD3依賴性CAGA-GFP報告基因活性，以及降低TGF-β/SMAD靶基因的轉錄水平來抑制TGF-β信號通路。TGF-β誘導的EMT也被ST3GAL5過表達所抑制。所有這些結果都表明，ST3GAL5而非B4GALNT是TGF-β信號傳導和TGF-β誘導的EMT的關鍵參與者。

ST3GAL5催化LacCer轉化為GM3，GM3是前體神經節苷脂，用于延伸和進一步支化反應，產生a系列神經節苷脂以及b系列神經節苷脂。兩種類型的神經節苷脂在NMuMG和A549細胞中均高表達。接下來，研究者研究了添加外源性神經節苷脂對TGF-β信號轉導的影響，發現a系列神經節苷脂處理后的兩種細胞對TGF-β誘導的SMAD3依賴性CAGA-GFP報告基因活性表現出顯著抑制，而b系列神經節苷脂處理的細胞與對照細胞相比沒有變化。此外，a系列神經節苷脂的外源添加消除了TGF-β誘導的間充質標志物的表達，TGF-β誘導的RFP標記波形蛋白表達的促進。此外，在用外源性a系列神經節苷脂刺激后，A549-VIM-RFP細胞在TGF-β處理后表現出比對照細胞更少的F-肌動蛋白形成。綜上所述，ST3GAL5合成的a系列神經節苷脂在TGF-β信號傳導和TGF-β誘導的EMT中起關鍵作用。

圖7

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6. ST3GAL5促進SMAD7-SMURF2誘導的泛素化和TβRI降解

接下來，研究者研究了ST3GAL5誘導TGF-β信號傳導抑制的機制。由于MDA-MB-231細胞中的內源性TβRI水平遠高于NMuMG細胞和A549細胞，因此使用MDA-MB-231細胞系來研究神經節苷脂對TβRI泛素化的影響。研究者觀察到，將外源性a系列神經節苷脂（GM1a、GM2或GM3）添加到感染HA-Ub慢病毒的MDA-MB-231細胞中可促進TβRI的泛素化。

此外，GM3誘導的TβRI泛素化增加因SMURF2的敲低而減弱，表明該E3連接酶參與TβRI的泛素化。定量結果顯示，GM3處理顯著降低了TβRI在細胞表面的表達，并且通過添加蛋白酶體抑制劑MG132或溶酶體抑制劑BafA1減弱了這種作用，表明GM3誘導的TβRI降解是通過蛋白酶體和溶酶體途徑介導的。這些結果表明，ST3GAL5催化的a系列神經節苷脂通過降低細胞表面表達和TβRI的穩定性來減輕TGF-β信號轉導反應并增加SMURF2誘導的TβRI泛素化。

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7. ST3GAL5的異位表達抑制A549細胞遷移、侵襲和轉移性生長，并與肺癌的良好預后有關

為了研究ST3GAL5和通過其催化活性在A549細胞遷移中產生的神經節苷脂的功能，研究者使用siRNA介導的ST3GAL5敲低或轉染對照siRNA對A549細胞進行了劃痕測定。ST3GAL5的過表達顯著抑制了TGF-β誘導的遷移。此外，添加GM1a、GM2或GM3會降低A549-VIM-RFP細胞在TGF-β刺激下的遷移能力。接下來，研究者分析了肺癌A549細胞中ST3GAL5錯誤表達對斑馬魚異種移植模型外滲的影響。將ST3GAL5耗竭或過表達的mCherry表達A549細胞注射到斑馬魚胚胎中，注射后4天計數血管外簇。在注射ST3GAL5敲低A549細胞的斑馬魚胚胎組中觀察到更多的血管間細胞簇。ST3GAL5的異位表達強烈抑制了斑馬魚模型中A549細胞的外滲。然后，研究者使用注射有或沒有ST3GAL5過表達的A549-Luc細胞的5周齡BALB/cnu/nu小鼠來研究ST3GAL5對細胞轉移生長能力的影響。結果與其在體外和斑馬魚異種移植模型中的發現一致，即在注射ST3GAL5過表達A549-Luc細胞的小鼠中檢測到初始細胞轉移的時間晚于注射A549-Luc對照細胞的小鼠。此外，ST3GAL5的異位表達抑制了循環A549細胞的早期轉移。

接下來，鑒于ST3GAL5在調節細胞遷移和侵襲中的關鍵作用，研究者研究了ST3GAL5是否可能是早期肺癌的相關生物標志物。使用982名肺癌患者的公開隊列，我們發現ST3GAL5的低表達與首次進展前的生存預后不良有關。此外，研究者通過使用ST3GAL5特異性抗體進行免疫組織化學（IHC）染色，檢查了組織微陣列中ST3GAL5蛋白水平，該陣列包含來自50名患者的150個肺癌組織和相鄰表型正常組織。與癌癥組織相比，ST3GAL5在鄰近的正常組織中高表達?？傊@些結果表明，ST3GAL5表達抑制細胞遷移、侵襲和轉移，并且與肺癌的良好預后相關。

圖11

圖12

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