編者按
濾泡性淋巴瘤（FL）是最常見的惰性淋巴瘤，具有臨床和遺傳異質性。盡管FL在目前治療的大多數患者中被認為是不可治愈的，但無進展生存期平均超過10年。然而，有一部分經歷早期復發的FL患者有明顯更高的發病率和死亡率。
今天我們來解讀一項2024年2月由美國加利福尼亞大學Lisa E. Wagar和斯坦福大學Ash A. Alizadeh團隊發表在Cell Stem Cell(IF=23.90)的最新研究——《A human lymphoma organoid model for evaluating and targeting the follicular lymphoma tumor immune microenvironment》。該研究利用原發性濾泡性淋巴瘤腫瘤活檢組織開發了一種患者來源的淋巴瘤類器官模型，證明了在無外源性細胞因子的情況下，3周內可保持體外微環境穩定性。接受雙特異性免疫療法治療后，類器官再現了T細胞介導的殺傷作用，從而可以研究影響應答的患者特異性微環境決定因素。
文章題目
A human lymphoma organoid model for evaluating and targeting the follicular lymphoma tumor immune microenvironment
雜志：Cell Stem Cell
影響因子：23.90
發表時間：2024年2月
作者及單位：美國加利福尼亞大學Lisa E. Wagar；斯坦福大學Ash A. Alizadeh等
論文翻譯：何玲玲
01、研究背景
濾泡性淋巴瘤（FL）是最常見的惰性淋巴瘤，具有臨床和遺傳異質性。盡管FL在目前治療的大多數患者中被認為是不可治愈的，但無進展生存期平均超過10年。然而，有一部分經歷早期復發的FL患者有明顯更高的發病率和死亡率。
免疫逃避是濾泡性淋巴瘤持續存在和進展的一個關鍵方面，未經治療的疾病的興衰性質表明抗腫瘤免疫機制的動態參與。惡性FL克隆與腫瘤微環境（TME）中其他細胞亞群之間的多種相互作用已被確定參與淋巴瘤維持或與臨床結果相關。隨著新型淋巴瘤免疫療法的出現，檢測和操縱這種動態相互作用的方法變得越來越重要，包括雙特異性T細胞參與抗體（雙特異性抗體）和細胞治療、嵌合抗原受體攜帶T細胞（CAR-T）。這些不同療法的免疫效應功能需要一個完整的TME，因此很難在傳統的體外B細胞單培養中建模。
來自非淋巴器官的類器官系統，包括肺、腸和大腦，在更準確地代表人體組織的TME方面表現出了巨大的潛力。由于免疫細胞發育要求的復雜性和多樣性，使用傳統的類器官技術生成能夠再現免疫TME的類器官一直具有挑戰性。
在過去的十年中，先前的研究對體外和體內生物工程技術做出了關鍵貢獻和改進以培養免疫細胞及其相應的TME治療淋巴瘤，但基本的局限性仍然是一個問題，包括依賴細胞系作為淋巴結或支持細胞的來源、長期培養的潛力尚不清楚、純小鼠或異種移植物淋巴組織的分析以及對外源性細胞因子的依賴。因此，先前對免疫細胞和TME建模的嘗試在其概括人類生理學的能力方面受到限制，并且尚未有助于改善臨床前模型的治療轉化。此外，在設計一刀切的療法時，人類適應性免疫反應和FL疾病在每個患者基礎上的固有變異性都增加了另一層復雜性。
一個強大的體外、高通量模型能夠使原代患者來源的惡性淋巴細胞在其天然TME中穩定共培養，可以加速我們對FL生物學的理解，包括個性化反應評估。本文中，研究團隊創建了來自原發性人類FL活檢的淋巴組織樣器官，并使用相應的患者源性淋巴瘤類器官（PDLOs）來分析新型免疫療法的機制基礎，包括CD3：CD19和CD3：CD20雙特異性抗體治療。
02、研究結果
1、患者來源性淋巴瘤類器官作為FL TME繁殖的平臺，在培養中是可行的和高度穩定的
為了開發和驗證濾泡性淋巴瘤的PDLO模型系統，研究團隊研究了12例濾泡性淋巴瘤患者的初級活檢，包括了在最初FL診斷、最初預期觀察、先前全身治療后疾病復發或侵襲性組織學轉化為彌漫大B細胞淋巴瘤時獲得的主要淋巴結組織的切除手術活檢樣本，這些PDLOs在培養體系中可以存活至少21天（圖1C），且能夠充分維持FL細胞和TME。接下來研究團隊評估了PDLOs中惡性淋巴瘤細胞的初始表現和縱向穩定性，發現PDLOs具有受性B細胞受體（BCR）輕鏈同型的CD3陰性細胞，與患者的臨床腫瘤免疫表型相匹配（圖1D-E）。
進一步在體外和縱向評估PDLOs中非B細胞群，發現FL TME中大多數非惡性細胞為T細胞群。盡管不同腫瘤之間的總T細胞比例不同，但隨著時間的推移，它們在單個PDLO中的表現在組成和頻率上是穩定的（圖1F）；同樣地，CD4和CD8 T細胞室在PDLO培養過程中都保持良好（圖1G-H）。當關注T濾泡輔助細胞（Tfh）時，之前被描述為FL TME中促進免疫逃避的關鍵亞群，研究團隊證實了CXCR5+PD-1+ Tfh群體在PDLO培養中保持穩定（圖1I）。
圖1
2、PDLOs中的腫瘤B細胞顯示出克隆性和突變性的穩定性
為了評估PDLOs在培養過程中的突變穩定性和潛在選擇，研究團隊使用CAPP-seq來評估培養前（第0天）和每周時間點（第7、14和21天）的錯義體細胞突變，確定了在培養3周內，類器官突變譜保持穩定（圖2A）。
進一步從RNA-seq數據中評估顯性BCR重鏈和輕鏈重排，并將其與基線時確定的顯性BCR重排進行了比較，發現盡管供體之間BCR限制性B細胞的比例是可變的（與每個患者活檢的腫瘤負荷水平一致），但在隨后的時間點，大多數供體的腫瘤BCR克隆比例是穩定的（（圖2B）。
接下來，研究團隊評估了培養第7、14和21天的一系列RNA基因表達數據?；虮磉_譜的無監督聚類顯示，來自個體患者的樣本存在共聚類，與穩定和患者特異性的TME組成一致（圖2C）。發現CREBBP突變與穩定性顯著相關（p = 0.014），而TP53突變的病例的穩定性顯著降低（p = 0.008，圖2D）?？傊魇郊毎g和分子分析表明，來自TME的腫瘤和非腫瘤免疫細胞在3周的培養期間是表型、突變和轉錄穩定的，PDLO技術成功地支持了原代淋巴瘤細胞的長期培養。
圖2
3、PDLOs概括了雙特異性免疫參與劑的治療反應
在證明了PDLOs對惡性腫瘤B細胞及其TME對應細胞的穩定性后，研究團隊接下來評估了該平臺是否可以用于復制T細胞依賴性免疫治療反應后的預期擾動。
在有足夠的活檢材料的情況下，研究團隊將CD3：CD19雙特異性抗體治療與相應的未偶聯的抗CD19和抗CD3單克隆抗體作為對照，發現未偶聯的抗體在PDLOs中的影響很?。▓D3A）。使用與最初的PDLO表征類似的多模態方法分析雙特異性免疫治療在每個PDLO中的效果（圖3A），發現雙特異性抗體治療后7天，CD3：CD19雙特異性抗體誘導每個PDLO中的淋巴瘤細胞顯著下降（圖3B）。
由于雙特異性抗體效應機制是T細胞依賴性的，研究團隊進一步評估了CD3：CD19抗體治療后的T細胞群體頻率和激活表型，發現總CD4+和CD8+ T細胞比例沒有被處理改變（圖3C）。對處理和未處理的PDLOs的基因集合富集分析顯示，與T細胞介導的免疫應答相關的多種通路上調，包括MAPK通路、PDL1通路和Th17細胞分化（圖3F）?？紤]到BCR克隆性作為淋巴瘤B細胞的特異性標記物，在CD3：CD19雙特異性抗體治療后，顯性單克隆BCR克隆型的頻率顯著降低，表明靶向雙特異性誘導的淋巴瘤細胞殺傷（圖3G）。
總之，這些數據表明，CD3：CD19雙特異性抗體治療的療效可以使用PDLOs在每個患者身上進行測量和表征。
圖3
4、PDLOs揭示了有效的雙特異性治療反應的相關性
考慮到PDLOs與B細胞單培養相比的多樣性，它們的一個潛在優勢是能夠評估個體患者反應的相關性。為了評估臨床相關的免疫治療，研究團隊使用雙特異性抗體治療相同患者的FL PDLOs，發現CD20：CD3雙特異性處理組與相同劑量CD3：CD19雙特異性抗體的類似實驗相比，誘導B細胞殺傷的幅度降低（圖4A）；被殺死的淋巴瘤細胞的比例顯示反應具有患者特異性和治療特異性（圖4B）；與CD3：CD20雙特異性抗體相比，CD3：CD19雙特異性抗體處理組能夠更好地誘導CD4+ T細胞活化（圖4D）；與CD3：CD20處理相比，CD3：CD19顯著誘導了更多的Tfh和非Tfh T細胞活化（圖4F）。
研究團隊進一步發現，Tfh激活與腫瘤殺傷之間存在顯著的正相關關系，而與非TfhT細胞激活之間幾乎沒有關聯（圖4G）。轉錄組學分析進一步顯示，CD3：CD19治療顯著誘導了關鍵的免疫檢查點的表達，包括TIGIT、LAG3、CTLA4和PD1（圖4H）。與CD3：CD20相比，CD3：CD19處理的培養上清液中細胞因子IFNg、TNF-a和IL-10的含量也更高（圖4I）。這些結果似乎與持續的T細胞激活可能誘導衰竭表型相一致，正如之前在持續的雙特異性暴露中觀察到的那樣。
圖4
03、編者點評
綜上所述，本研究介紹了一種用于培養患者來源的淋巴瘤類器官（PDLOs）的培養方法，其包括原代TME的細胞。通過成功培養來自不同患者的冷凍保存的FL標本，并在3周內證明了TME細胞組成、腫瘤體細胞突變、基因表達譜和B/T細胞受體動力學的穩定性，從而確定了該體系的穩定性。
經CD19：CD3和CD20：CD3雙特異性抗體處理的PDLOs具有B細胞殺傷和T細胞活化作用。這個PDLOs系統可以通過患者特異性建模、高通量篩選、TME特征識別和治療反應評估，為推進FL的個體化精準醫療提供一個強大的平臺。
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