2、mirbase數(shù)據(jù)庫中human，mouse，rat全部成熟體序列microRNA；
3、circbase數(shù)據(jù)庫中human，mouse全部circRNA；
其次，也是最重要的，就是基因堅持的三個最重要的設(shè)計原則：
1、引物跨內(nèi)含子設(shè)計，避免基因組污染帶來的影響；
2、引物在基因（NCBI Refseq）對應(yīng)的所有轉(zhuǎn)錄本同源區(qū)設(shè)計；
3、引物特異性，設(shè)計引物全部使用NCBI primer-blast比對工具進行引物特異性比對；
最后，就是設(shè)計方法。qPCR使用的方法都是是染料法，使用的熒光染料就是常用的SYBRGreen I。該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結(jié)合并發(fā)光的特性，檢測PCR的全部進程，從而判定初始RNA的量。染料法的優(yōu)勢是使用簡單，成本也相對較低。下面簡單介紹下mirbase數(shù)據(jù)庫和circbase數(shù)據(jù)庫中兩類基因的qPCR引物設(shè)計方法。
1、circbase數(shù)據(jù)庫中circRNA引物設(shè)計方法-常規(guī)qPCR設(shè)計方法
CircRNA成環(huán)方式有很多種，簡單說明下外顯子環(huán)化的circRNA和內(nèi)含子環(huán)化的circRNA兩類設(shè)計方法。對于外顯子環(huán)化的circRNA，引物需要跨剪切位點（backsplice）設(shè)計；對于內(nèi)含子環(huán)化circRNA，可跨剪切位點設(shè)計，也可圍繞內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計引物。circRNA的正向引物和反向引物（Divergent PCR ）與線性mRNA的正向引物和反向引物（convergent PCR）設(shè)計方向剛好是相反的。circRNA跨剪切位點（backsplice）設(shè)計示意圖如下：
2、mirbase數(shù)據(jù)庫中成熟體microRNA引物設(shè)計方法-莖環(huán)法
由于成熟體miRNA較小，無法用常規(guī)的方法直接進行反轉(zhuǎn)錄、PCR 。所以對于mirbase數(shù)據(jù)庫中的成熟體microRNA使用的是莖環(huán)法，也就是將miRNA配對的序列延長，然后進行正常的反轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的PCR檢測。莖環(huán)法原理圖如下：
引物產(chǎn)品具有高擴增效率和高靈敏度的特點，保證每次實驗的可靠定量，無非特異性擴增和引物二聚體，確保實驗的可重復(fù)性和實驗數(shù)據(jù)的可靠性。