2、mirbase數據庫中human，mouse，rat全部成熟體序列microRNA；
3、circbase數據庫中human，mouse全部circRNA；
其次，也是最重要的，就是基因堅持的三個最重要的設計原則：
1、引物跨內含子設計，避免基因組污染帶來的影響；
2、引物在基因（NCBI Refseq）對應的所有轉錄本同源區設計；
3、引物特異性，設計引物全部使用NCBI primer-blast比對工具進行引物特異性比對；
最后，就是設計方法。qPCR使用的方法都是是染料法，使用的熒光染料就是常用的SYBRGreen I。該方法利用了SYBRGreen熒光染料非特異性與雙鏈DNA結合并發光的特性，檢測PCR的全部進程，從而判定初始RNA的量。染料法的優勢是使用簡單，成本也相對較低。下面簡單介紹下mirbase數據庫和circbase數據庫中兩類基因的qPCR引物設計方法。
1、circbase數據庫中circRNA引物設計方法-常規qPCR設計方法
CircRNA成環方式有很多種，簡單說明下外顯子環化的circRNA和內含子環化的circRNA兩類設計方法。對于外顯子環化的circRNA，引物需要跨剪切位點（backsplice）設計；對于內含子環化circRNA，可跨剪切位點設計，也可圍繞內含子區域設計引物。circRNA的正向引物和反向引物（Divergent PCR ）與線性mRNA的正向引物和反向引物（convergent PCR）設計方向剛好是相反的。circRNA跨剪切位點（backsplice）設計示意圖如下：
2、mirbase數據庫中成熟體microRNA引物設計方法-莖環法
由于成熟體miRNA較小，無法用常規的方法直接進行反轉錄、PCR 。所以對于mirbase數據庫中的成熟體microRNA使用的是莖環法，也就是將miRNA配對的序列延長，然后進行正常的反轉錄及后續的PCR檢測。莖環法原理圖如下：
引物產品具有高擴增效率和高靈敏度的特點，保證每次實驗的可靠定量，無非特異性擴增和引物二聚體，確保實驗的可重復性和實驗數據的可靠性。