編者按

 晝夜節律是生物在進化過程中形成的適應地球自轉的生物節律之一，表現為機體在內部生物鐘控制下產生的約為24 h的循環周期生物節律，協調睡眠/覺醒、體溫調節、內分泌時相等活動，長期晝夜節律失調可引起代謝紊亂、胃腸疾病、神經退行性疾病等患病風險增高。水生生物斑馬魚（Danio rerio）作為典型的模式動物，已被廣泛應用于晝夜節律實驗研究中。

今天，我們分享2024年1月由解放軍疾病預防控制中心、中國醫科大學公共衛生學院研究團隊發表的綜述性文章《斑馬魚模型在晝夜節律研究中的應用進展》，該文詳細介紹了斑馬魚生物鐘的運行機制、輸入系統的影響因素、生物鐘基因及通路、生理性輸出，總結了在晝夜節律研究中的應用及優勢，并展望了未來研究發展，以期為晝夜節律調控機制研究和相關藥物研發以及疾病治療策略提供理論支持。

文章題目

斑馬魚模型在晝夜節律研究中的應用進展

雜志：《Mil Med Sci》（Vol 48，No 1）

發表時間：2024年1月

作者：宗尤佳、李雨濃、郭家彬、彭輝等

單位：解放軍疾病預防控制中心、中國醫科大學公共衛生學院等

01、研究背景

生物節律是生物體內生理、生化和行為活動發生自主周期性波動變化的現象，其周期可以是秒、天、月、年，如反映月節律的生殖周期，反應年節律的冬眠夏蟄等。晝夜節律則是內源性晝夜節律振蕩器產生的約 24 h的生物日節律，它參與了多項生理過程的調節，如睡眠?覺醒周期、體溫、血壓、激素分泌、代謝和免疫系統功能等。

在晝夜節律內的不同時相，生理反應存在較大差異，基于此研究揭示外源性有害因素與內源性生物節律相互作用的時間毒理學，以及探索不同時段給藥以獲得最大療效和最小不良反應的時間治療學，具有重要的現實意義。

生物鐘的準確性和穩定性與機體健康息息相關，長期晝夜節律失調可引起代謝紊亂，并導致胃腸疾病、Ⅱ型糖尿病等，還與精神障礙、神經退行性疾病、心臟病和癌癥等疾病發生有關，所導致的身體健康問題值得廣泛關注。常見的軍事作業環境，如艦艇長期噪聲、坑道不規則光照、密閉艙室不適溫度、睡眠環境顛簸起伏及白夜班輪值頻繁等，均會造成軍人晝夜節律紊亂，降低軍人警覺性、積極性和身體執行能力，影響戰斗力輸出。

在一些特殊軍事作業場景，如飛行員洲際跨時區作業、戰艦潛艇長遠航、宇航員空間站工作生活、特種兵國際比武適應時差、地下掩體狹小空間長時戰斗等，維持機體晝夜節律已成為研究保障軍人健康和軍事作業效能的重要課題。斑馬魚（Danio rerio）與人類基因同源性高、個體變異性小、飼養容易，在進化過程中表現出與哺乳動物相似的晝夜節律行為，越來越多的研究證明，斑馬魚可成為研究晝夜節律的模式動物。

本文主要就斑馬魚模型在晝夜節律研究中的研究進展進行論述，詳細介紹了斑馬魚生物鐘運行機制、輸入系統影響因素、生物鐘基因及通路、生理性輸出，總結了其在晝夜節律研究中的優勢及應用，并展望了未來研究發展，以期為晝夜節律調控機制研究、藥物研發及治療策略提供更多理論支持。

02、研究成果

1. 斑馬魚生物鐘運行機制

生物鐘是由生物體自身發展的一種內源性計時機制，表現為進化上高度保守的機體節律生物反應。晝夜節律的產生和維持在整體水平依賴于生物鐘系統、晝夜節律輸入系統和晝夜節律輸出系統的協同作用，在細胞水平依賴于內源性生物鐘基因網絡的精密調控。晝夜節律遺傳學基礎來自生物鐘基因的振蕩表達，包括核心鐘基因（Bmal1、Clock、Cry、Per）和鐘控基因（Rev ? erbα、Rorα、Dbp、Tef、Hlf等）。

斑馬魚生物鐘的基本運行機制與哺乳動物相似，其晝夜節律調控系統由中樞和外周生物鐘系統、節律輸入系統和節律輸出系統組成。節律輸入系統感受并向中樞生物鐘系統傳遞以光信號為代表的環境同步信號，中樞生物鐘系統作為晝夜節律主起搏器通過輸出系統將產生的節律信號傳遞至外周，并與外周器官內源性生物鐘系統協同作用維持機體的生理活動。

晝夜節律的主起搏器位于特定的大腦區域，哺乳動物主要位于視交叉上核，而非哺乳脊椎動物主要位于松果體。松果體是生物體主時鐘視交叉上核附屬振蕩器，起到晝夜節律的神經內分泌轉換器的作用。斑馬魚的核心生物鐘位于松果體內，它具有感光性，可接收來自視網膜輸入系統的光信號，調節睡眠?覺醒周期、運動活動、產卵、攝食等明顯的節律輸出；同時它還可協調褪黑素的釋放，通過對激素釋放的調控進一步影響晝夜節律。

2. 輸入系統影響因素

晝夜節律的輸入系統由黑視蛋白、視網膜下丘腦束RHT及視交叉上核SCN組成，輸入系統可感受核心授時因子 Zeitgeber —光照信號變化進而調控中樞生物鐘基因的表達。

2.1 光照

人類和動物研究的證據表明，光照是影響魚類晝夜節律的最關鍵因素。斑馬魚具有多種內源性晝夜節律振蕩器，可通過視覺和非視覺外圍光感受器直接被光刺激所啟動。

斑馬魚松果體和視網膜等感光器官或組織，作為晝夜節律輸入系統，可將光信息直接傳遞給大腦，不受其他晝夜節律振蕩器的影響。在Per2和Cry1a核心鐘基因啟動子中存在“光響應模塊”，該模塊由對鐘控基因的轉錄調控起重要作用的順式元件 E?box、D?box等組成。光信號通過各種信號轉導途徑從黑視蛋白傳輸到生物鐘基因，這些轉導途徑涉及作為激活或阻抑作用的E?box和D?box元件，從而對斑馬魚機體晝夜節律產生調控。

2.2 視網膜

斑馬魚視網膜與人類相似，由視錐細胞、視桿細胞和色素上皮細胞等組成，可伴隨光線和（或）晝夜節律的變化而出現形態重排，形成具有節律性的視網膜運動現象。

Zang等通過視網膜電流圖發現，斑馬魚的光反應恢復在晚上延遲、在早上加快，表明斑馬魚視網膜視錐視覺轉導的關鍵調節因子處于晝夜節律控制之下。Shi等通過孕激素的地屈孕酮暴露改變了斑馬魚視網膜時鐘基因的轉錄，結果顯示 Per1b 的轉錄水平降低；Per1b 缺失引起視網膜多巴胺能缺乏，導致斑馬魚視覺缺陷，影響斑馬魚晝夜節律。Huang等通過光動反應測定Per2突變的斑馬魚幼魚發現，對比敏感度和視力下降，表明視網膜生物鐘響應外部光照的強弱進而調節視覺敏感度。

2.3 視蛋白

視蛋白是動物體內普遍存在的光敏蛋白，目前在斑馬魚中已發現 32種非視覺視蛋白和10種視覺視蛋白，其中多數處于時鐘控制之下，表現出強大的晝夜節律。負責非成像感光的黑視蛋白基因opn4廣泛表達于斑馬魚視網膜各種細胞類型中，在生物鐘晝夜節律等功能調節方面起著至關重要的作用。

Dekens等通過opn4.1和 opn4xb 基因雙敲除的斑馬魚模型研究發現，相較于野生型斑馬魚，基因敲除的斑馬魚清醒狀態下運動活動能力下降，體內褪黑素水平升高且per2轉錄水平降低，表明opn4.1和opn4xb基因對調節斑馬魚晝夜節律起到關

鍵作用。

3. 生物鐘基因及通路

3.1 分子調控機制

生物鐘基因是在細胞、組織和機體水平上調節生理晝夜節律所需的基因。在分子水平上，生物鐘由一系列生物鐘基因相互作用形成。生物鐘基因產物的表達、積累和降解的自動調節，形成自主分子振蕩器。多個轉錄因子、核受體和協同調節因子

通過結合特殊的DNA識別序列，驅動日常周期的振蕩，最終在機體上形成了生命過程的生物鐘形態。

斑馬魚的生物鐘基因與哺乳動物高度相似，Clock和Bmal基因充當正調節因子，Period 和Cryptochrome基因充當負調節因子。 此外 ，Nr1d1、Nr1d2、Dec1和Dec2等基因也參與了晝夜節律的調控。

3.2 核心反饋回路

斑馬魚生物鐘調節中，正調節因子（Clock和Bmal）驅動下游負調節因子（Period和Cryptochrome）的表達，負調節因子進而反饋下調正調節因子，從而構成了生物鐘的核心反饋回路。

Clock 和 Bmal1基因可編碼基本螺旋?環?螺旋?PAS轉錄因子家族成員的蛋白質，通過與含 PAS結構域的蛋白質相互作用，CLOCK 和 BMAL1 在細胞質中形成異二聚體復合物，然后轉移到細胞核并與 E?box 增強子序列結合，進而激活生物鐘基因的轉錄。Period（Per1 和Per2）和Cryptochrome（Cry1和Cry2）基因的蛋白質產物通過抑制CLOCK與BMAL1的結合來降低自身的轉錄，從而構成自動調節反饋回路。

Clock、Bmal、Period 和 Cryptochrome 基因均在調節晝夜節律中發揮重要作用。Basti等發現，下調斑馬魚生物鐘基因Bmal1的表達可影響其晝夜節律的調節。Yang 等通過殺菌劑噻呋酰胺暴露破壞了斑馬魚晝夜節律，結果顯示與晝夜節律相關的正調節基因（Clock1a、Clock2、Bmal1a和Bmal2）和調節基因（Per1a、Per1b、Per2、Per3、Cry1aa、Cry1ab、Cry1ba 和 Cry1bb）的 mRNA 水平均發生顯著改變，Clock1a 和生物鐘蛋白水平的變化導致斑馬魚胚胎缺陷、異常行為和代謝紊亂。

3.3  Nr1d反饋回路

通過與E?box增強子結合，CLOCK：BMAL1異二聚體復合物激活生物鐘基因 Nr1d1 的轉錄。Nr1d1基因編碼核受體超家族 REV?ERBα蛋白，該蛋白與類維生素 a相關孤兒受體 ROR 一起，通過結合位于Bmal1基因啟動子中的視黃酸相關孤兒受體反應元件 RORE 來抑制 Bmal1 轉錄，從而形成另一個節律性反饋回路。

Nr1d1作為生物鐘第二個反饋回路的主要組成部分，對晝夜節律的調節起到關鍵作用。Wang 等使用攜帶 Nr1d1 啟動子驅動的不穩定熒光蛋白的轉基因斑馬魚，開展了單細胞水平的體內晝夜節律研究，發現 Nr1d1 隨著發育過程逐漸表達出來，且Nr1d1直接受BMAL1調控并抑制Bmal1的表達，進而參與晝夜節律調控。

4. 生理性輸出

晝夜節律的輸出系統包括神經內分泌系統和自主神經系統兩大途徑，晝夜節律紊亂會導致斑馬魚出現睡眠?覺醒周期變化、運動活動減慢、產卵量下降和食物攝入量減少等生理性輸出改變。

4.1 睡眠?覺醒

晝夜節律最為典型的生理性輸出是睡眠?覺醒周期。下視丘分泌素（hypocretin，Hcrt）是斑馬魚睡眠?覺醒的重要調節因子，可與去甲腎上腺素、褪黑素等相互作用，調節睡眠?覺醒周期，Hcrt過表達會顯著增加斑馬魚覺醒［29］ 。Elbaz等研究發現，Hcrt神經元消融的斑馬魚幼魚白天睡眠增加，夜間睡眠片段化。Nishimura等發現hcrt突變體（hcrt-/-）幼魚白天睡眠?覺醒轉換的增加，Hcrt神經元被特異性激活。

褪黑素是一種松果體激素，在恒定光照/黑暗條件下的夜間分泌，它可通過調節重要的生物鐘基因的表達進一步影響斑馬魚晝夜節律，并調節睡眠?覺醒周期 。Yang等研究結果表明，高效植物激素6?芐基氨基嘌呤通過增加斑馬魚覺醒時長、減少休息時長和誘導生物鐘基因表達破壞等，擾亂了斑馬魚幼魚的節律活動；增加褪黑素則可減輕晝夜節律紊亂，對斑馬魚睡眠?覺醒穩定起到保護作用。Jiang等研究發現，潑尼松龍暴露可導致斑馬魚Per和Cry基因的表達上調，褪黑素分泌減少和睡眠時間縮短。

芳香胺?N?乙?；D移酶（arylalkylamine?N?acetyltransferase，AANAT）是褪黑素生物合成過程中關鍵的限速酶，控制脊椎動物松果體中褪黑素產生的晝夜節律性。斑馬魚的 aanat 基因有兩個亞型：aanat1和aanat2，后者是褪黑素合成的主要基因，參與調節睡眠?覺醒周期。Wei等研究發現，aanat2突變斑馬魚夜間活動相比野生型對照組增加了25%，整個晝夜節律相位提前，向前推進了約3.7h且周期縮短了0.9 h，晝夜節律幅度減弱。

4.2 產卵

產卵是斑馬魚具有晝夜節律特性的輸出之一，產卵和繁殖行為與晝夜節律存在密切聯系。產卵活動通常在黑暗周期結束后暴露在光線下的第一分鐘內開始，持續約15min到1h；在恒定的光照下，產卵節律保持其晝夜節律。Adatto等研究發現，最明顯的胚胎生產高峰出現在黎明時或在給予光照后即刻，擾亂晝夜節律周期會導致斑馬魚胚胎產量下降，產卵高峰推遲和下降。

4.3 運動活動

運動活動被認為是斑馬魚成魚和幼魚晝夜節律的代表性輸出，表現為光照周期有強烈的游泳活動，黑暗周期有類似睡眠的行為。

Audira 等研究發現，與黑暗周期相比，斑馬魚光照周期平均速度和快速移動時間相對較高，而水平蜿蜒和凍結/運動時間比相對較低。Yang等通過不同化學物質暴露研究斑馬魚行為的晝夜節律，結果表明斑馬魚在光照期間的游泳行為能力高于黑暗期間 。Luchtenburg 等對斑馬魚幼魚進行了視覺運動反應測試發現，黑暗時期斑馬魚的游泳速度增加，誘導了類似焦慮的行為；當燈再次打開時，斑馬魚運動迅速恢復到基礎水平，表明斑馬魚的運動活動具有典型的晝夜節律性。

4.4 攝食

斑馬魚的攝食行為也體現出晝夜性節律。研究人員通過構建斑馬魚自我飼喂系統發現，斑馬魚具有明顯的夜間進食節奏，進食需求集中在黑暗階段的最后4h，且這種節奏是內源性的，在自由游動的條件下持續存在。

Sbragaglia 等通過開展斑馬魚大小尺寸選擇性死亡實驗研究魚類進化，結果顯示clock1a、per1b和arntl1a等生物鐘基因的表達在不同尺寸死亡組發生改變，晝夜振蕩表達存在明顯差異，但所有處理組斑馬魚在黑暗的最后幾個小時均存在自主進食活動，表明了自我攝食活動的內在晝夜節律調節的強大適應性和穩固性。

5. 用于晝夜節律研究的優勢

與小鼠、果蠅等晝夜節律研究模式動物相比，斑馬魚已被廣泛證明擁有大量已識別的生物鐘基因和有據可查的晝夜節律活動模式，在晝夜節律實驗開展中具有眾多優勢：

第一，與人類相同的晝夜節律時相。小鼠雖是常用的晝夜節律實驗動物，但其主要睡眠階段在白天，與人類睡眠時相相反；斑馬魚主要在光周期活動、暗周期睡眠，與人類睡眠時相相符；

第二，更豐富的生物鐘基因。與果蠅和小鼠相比，斑馬魚由于存在第三次全基因組復制，體內存在豐富的生物鐘基因拷貝，如正調節因子Clock（1a、1b、2）Bmal（1a、1b、2），負調節因子Per（1a、1b、2、3）、Cry（1ab、1bb、1b）等；

第三，更穩定可靠的調控系統。斑馬魚外周生物鐘可直接受光控制，不需要類似于哺乳動物視交叉上核的“主振蕩器”來協調整個身體的晝夜節律，晝夜節律網絡比

哺乳動物更加分散可靠；此外，小鼠近交系中缺乏合成褪黑素所需要的酶，使用這些小鼠品系的晝夜節律研究可能會低估松果體和褪黑素本身的作用；

第四，更易操作和更低的研究成本。與小鼠、獼猴等相比，斑馬魚與人類基因組高度相似，體積小，易操作，養殖成本低，孵化快，研究周期短，透明的胚胎更易開展發育研究；轉基因技術成熟，易構建足夠數目的具有統一遺傳背景的模型；與灌胃、注射等給藥方式相比，斑馬魚經水體直接暴露可減少試驗操作手法的差異和動物的不適感，都使斑馬魚成為研究晝夜節律和睡眠過程的一種理想模式動物。

6. 在晝夜節律研究中的應用

鑒于斑馬魚在晝夜節律相關研究中的獨特的優勢，其胚胎、幼魚被廣泛應用于晝夜節律相關的新型環境污染物毒性評價和藥物安全性評估。

Cao等通過四溴二苯醚 BDE?47暴露于斑馬魚幼魚發現，夜間opn4基因表達下降，白天opn4a和opn4.1表達增加，黑視蛋白系統發生擾亂，導致晝夜節律紊亂。Luan 等通過微塑料暴露引起了斑馬魚Bmal1b表達降低、Clock1a表達增加，而Per1b表達隨著微塑料暴露量增加而減弱，Cry1a表達水平降低，擾亂了斑馬魚幼魚的晝夜節律。Zheng等通過鎘暴露擾亂了斑馬魚的晝夜節律信號，結果顯示Nr1d1、Nr1d2a、Nr1d2b基因表達下調，Nr1d1表現出強烈的晝夜節律表達模式。Aranda?Martínez等使用神經毒素 MPTP 誘導斑馬魚胚胎形成帕金森癥，導致褪黑素晝夜節律消失，斑馬魚幼魚夜間活動增加。Chen 等通過建立高通量與自動化處理相結合的晝夜行為篩選方法，發現神經活性藥物米氮平和殺菌劑噻蟲嗪增加了斑馬魚幼魚晝夜節律長度和幅度。

03、展望

生物鐘是由生物體自身發展的一目前應用斑馬魚開展晝夜節律實驗還主要集中在單獨行為監測、生物鐘基因及蛋白表達檢測等，對具體調節晝夜節律的分子機制研究還不夠深入；同時，斑馬魚基因敲除還面臨脫靶高和潛在免疫反應等問題，相關的實驗模型及方法仍需完善。

未來，基于斑馬魚開展晝夜節律的研究將進一步受益于新技術的推廣應用，如大規模組學分析（轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學）、轉基因脊椎動物（基因敲降或敲除、特異熒光標記）、計算生物學（生物大數據和計算毒理分析）和先進的實驗室方法（移動追蹤平臺、新型體積成像、自動化解決方案）等，甚至是多交叉學科方法的整合。這些都將推動斑馬魚應用到晝夜節律相關機制的深入研究，為相關藥物研發和疾病治療策略提供更多理論支持。

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型、人誘導多能干細胞及多種癌種的類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！