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細胞遷移侵襲實驗中基質膠的應用

基質膠是從富含胞外基質蛋白EHS小鼠腫瘤中提取出的可溶性基底膜制備物，其主要成分由層粘連蛋白，Ⅳ型膠原，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）和巢蛋白等組成，還包含生長因子如TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物和EHS腫瘤自身含有的其他生長因子。

在1980年代中期由丹麥的 J. Engelbreth-Holm和Richard Swarm二者分別發現并具體描述基質膠^【1】，其主要生產過程是用鹽水提取/洗滌腫瘤勻漿后可溶性蛋白質，再用溶劑萃取產物中不溶性復合物，在低溫下使用緩沖液進行透析后獲得無色到淡黃色溶液。

表：基質膠組分^【1】

基質膠為組織和細胞提供支撐、抗拉強度和支架支撐，也可以作為細胞粘附和運動的三維亞結構以及生長因子、趨化因子和細胞因子的儲存庫，同時可作為細胞形態發生和分化的信號等。

翌圣生物開發生產的CeturegelTM基質膠不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），超低內毒素含量，并全部經過支原體檢測保證無支原體污染，包括基本濃度、高濃度、低生長因子等不同類型基質膠。

應用方向

產品特點

特點：

• 安全性高：不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒）

• 濃度多樣性：濃度范圍在8~20 mg/ml之間

• 批次穩定性好：嚴格生產質檢過程保證批次間性能穩定

• 低內毒素：內毒素含量≤4 EU/ml

• 污染物檢測： 經檢測無支原體和細菌、真菌殘留

• 單批產量高：單批產量在L級別以上

• 兼容性好：可與任何類型的細胞培養基兼容
  
  
  

遷移侵襲驗證

圖：遷移侵襲實驗過程

1 基質膠鋪板

首先將拿到的CeturegelTM基質膠凍融后按照原液1:8用無血清培養基稀釋（終濃度不要超過3mg/ml）來包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃、30min使CeturegelTM基質膠聚合成凝膠，使用前進行基底膜水化。

2 制備細胞懸液

1將細胞饑餓12-24h以去除血清的影響（可選）。

2消化細胞，終止消化后離心棄去培養液并用PBS洗1-2次，用含BSA的無血清培養基重懸調整細胞密度至4×104~2×105個/ml。

3 細胞接種

1取細胞懸液100μl加入Transwell小室。

2在24孔板下室加入600μl含20%FBS培養基，添加時要避免下層培養液和小室間產生氣泡，產生氣泡易使下層培養液的趨化作用減弱甚至消失。

3培養細胞:常規培養12-48h(時間主要依癌細胞侵襲能力而定)。

4 結果統計

1取出Transwell小室，棄去孔中培養液，用不含鈣的PBS清洗2遍，4%多聚甲醛固定30分鐘，將小室適當風干。

2然后使用0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍于400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數。

圖：細胞侵襲后經結晶紫染色的結果

FAQ

Q1拿到的基質有色差的變化（淡黃色到深紅色）是什么原因？

A對于含酚紅的基質膠主要原因是由于酚紅和碳酸氫鹽與CO2作用引起的，但是與5％CO2平衡后色差即會減少。凍融后，輕輕搖晃試劑瓶使基質膠分散均勻。

Q2基質膠的操作要注意哪些事項？

A所有操作需在無菌環境下進行，應使用預冷的移液器以保證基質膠呈勻漿狀。

Q3基質膠的如何分裝凍存使用？

A可將凍融后的CeturegelTM基質膠分裝在多個小管，所有分裝均需用預冷的凍存管，迅速冷凍并保存，避免多次凍融。所有涉及到使用的物品在使用前需預冷，使用預冷的移液管、吸頭及小管等操作基質膠。

[1] Kleinman H K , Martin G R . Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.[C]// Seminars in Cancer Biology. 2005.

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