研究背景
過繼性T細(xì)胞療法是指從腫瘤患者體內(nèi)分離免疫活性細(xì)胞，在體外進(jìn)行擴(kuò)增和功能鑒定，然后向患者回輸，從而達(dá)到直接殺傷腫瘤或激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。而人類T淋巴細(xì)胞是高度動(dòng)態(tài)的。在許多變化中，最值得關(guān)注的是從na?ve T細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵诃h(huán)境暴露后獲得抗原經(jīng)歷的記憶和效應(yīng)T細(xì)胞。這些表型變化，包括T細(xì)胞耗竭和衰老的誘導(dǎo)，有可能對過繼性T細(xì)胞療法(ACT)的療效產(chǎn)生負(fù)面影響。因此在ACT治療中，確定譜系穩(wěn)定的T細(xì)胞顯得尤為重要。
為了篩選更適用于ACT治療的T細(xì)胞亞群，來自佛羅里達(dá)大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員比較了來源 臍帶血（cord blood，CB）與來源于成人外周血（adult peripheral blood，APB）中分離的人類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的表型特征，通過單細(xì)胞層面（scRNA-seq 和流式細(xì)胞術(shù)）和組織層面（蛋白芯片和細(xì)胞因子檢測）對新鮮和離體擴(kuò)增的 Treg 亞群進(jìn)行了分析，這些數(shù)據(jù)都支持使用擴(kuò)增后的臍帶血Treg 是治療自身免疫和炎癥疾病的潛在最佳免疫細(xì)胞治療方式。該項(xiàng)題為“Human Regulatory T Cells From Umbilical Cord Blood Display Increased Repertoire Diversity and Lineage Stability Relative to Adult Peripheral Blood”的研究發(fā)表在Frontiers in immunology上。
技術(shù)路線
1. scRNA-seq 識別APB Treg和CB Treg細(xì)胞群組成差異
單細(xì)胞分析將APB Treg和CB Treg劃分為6個(gè)細(xì)胞亞群，其中C01-C05細(xì)胞亞群聚集在一起，C06細(xì)胞亞群出現(xiàn)明顯的離群現(xiàn)象，這種離群現(xiàn)象在APB Treg中表現(xiàn)尤為明顯。表達(dá)譜分析結(jié)果同樣也表現(xiàn)出APB Treg和CB Treg的差異——Treg marker基因，F(xiàn)OXP3 和 IKZF2，在C01-C05細(xì)胞亞群中高表達(dá)，在C06細(xì)胞亞群中低表達(dá)，與 CB 相比，這些趨勢在 APB 中更為突出，因?yàn)?APB 中存在大量非Treg表型的污染物簇的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，與包含具有細(xì)胞毒性和促炎潛力的非 Treg TH1/17 污染物的 APB Treg 相比，CB Treg 轉(zhuǎn)錄組學(xué)譜作為譜系更同質(zhì)。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析不同來源Treg細(xì)胞的細(xì)胞群組成差異
2. TCR-seq揭示CB Treg 免疫組庫高度多樣化
先前的研究表明，Treg細(xì)胞通常表現(xiàn)為TCR多樣性，本文將研究領(lǐng)域進(jìn)一步擴(kuò)充到對APB and CB Tregs的TCR多樣性探討，通過比較兩種細(xì)胞來源的TCR-α和TCR-β鏈上CDR3序列擴(kuò)增多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)APB Treg相比于CB Treg的多樣性降低。并且，與源自 APB的Treg相比，CB Treg可能是組織移植的最佳選擇，因?yàn)镃B Treg具有更多表達(dá)對自身抗原反應(yīng)的 TCR 的克隆。
TCR分析 Treg 中的CDR3序列多樣性
3. 擴(kuò)增后的 CB Treg 保留譜系穩(wěn)定性
在過繼性 T 細(xì)胞療法（ACT）中實(shí)現(xiàn)臨床有效的 Treg 數(shù)量通常需要細(xì)胞擴(kuò)增。此外，還要求Tregs 必須保持調(diào)節(jié)特性以及擴(kuò)增后循環(huán)和激活的能力。作者利用微陣列表征在體外擴(kuò)增14天的CB和APB衍生的Tregs和Tconv（conventional T cells）的轉(zhuǎn)錄組，CB Tregs的大量轉(zhuǎn)錄組分析支持它們的譜系穩(wěn)定性和擴(kuò)增后免疫抑制表型的保留。
來自擴(kuò)增細(xì)胞的大量基因表達(dá)譜顯示來自CB的Tregs和Tconv的調(diào)節(jié)表型增加
4. 擴(kuò)增后的CB Tregs表現(xiàn)出高度激活和免疫抑制的表型
接下來，作者通過流式細(xì)胞術(shù)和Luminex平臺檢測擴(kuò)增后CB和APB衍生的Treg和Tconv的表型和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論來源（CB或APB）如何，擴(kuò)增后的CB Treg與APB Treg以及擴(kuò)增后的CB Tconv與APB Tconv的細(xì)胞因子產(chǎn)生和表型特征最相似，但確實(shí)觀察到APB Treg相對于CB Treg產(chǎn)生更多的IL-2。這可能由于APB Treg具有更多的非Treg污染物，Treg細(xì)胞的生長發(fā)育需要依賴更多的外源性IL-2。
從表型上看，作者發(fā)現(xiàn)CB Tregs比APB Treg更活化，且CB Treg 具有增強(qiáng)的免疫抑制能力，CB Treg可通過細(xì)胞外 ATP 轉(zhuǎn)化為腺苷和激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而不會屈服于 Treg 耗竭。
綜上所述，除了轉(zhuǎn)錄譜外，這些數(shù)據(jù)表明，與APB Treg相比，CB Treg保持了高度激活的狀態(tài)和免疫抑制表型。
擴(kuò)增后的APB Treg和CB Treg的細(xì)胞因子表達(dá)譜
流式細(xì)胞術(shù)分析APB Treg和 CB Treg的激活和免疫抑制表型
小結(jié)
在細(xì)胞免疫治療時(shí)，Treg通過多種機(jī)制發(fā)揮其抑制功能。正是這種治療特性的組合引起了人們對利用Tregs在自身免疫或移植情況下建立長期耐受性的極大興趣。本文采用單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq) 和T細(xì)胞受體 (TCR) 分析來表征可用于ACT的CB和APB Treg群體。與APB相比，轉(zhuǎn)錄譜數(shù)據(jù)和TCR分析再次強(qiáng)化了CB中表型同質(zhì)和譜系穩(wěn)定的Treg群體的概念。這些研究對確定自體或同種異體ACT應(yīng)用的最佳細(xì)胞來源具有重要意義。同時(shí)文章通過免疫因子檢測，確定了Treg細(xì)胞的生長發(fā)育依賴細(xì)胞因子IL-2，為后續(xù)臨床研究提供更夯實(shí)的理論基礎(chǔ)。
另一方面，免疫因子主要產(chǎn)生于各類免疫細(xì)胞，同時(shí)又能調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化凋亡，從而形成了一套精密且復(fù)雜的免疫調(diào)控機(jī)制。為了對該復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行更系統(tǒng)全面的研究，針對免疫的高通量組學(xué)手段——如本文用到的免疫因子組及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組正被越來越多地用于系統(tǒng)免疫研究中。