編者按
乳腺纖維腺瘤（FAs）是一種纖維上皮腫瘤，常見于青春期女性，長期患有會增加患乳腺癌的風險。剖析人類乳腺FAs的病理機制對于開發更有效的治療方法至關重要。然而，凋亡的癌細胞對鄰近腫瘤上皮細胞的直接影響以及如何潛在促進治療耐藥尚不清楚。
2023年6月18日，浙江大學醫學院附屬第二醫院、浙江省腫瘤微環境與免疫治療重點實驗室黃建、陳志剛團隊在《Nature Communications》雜志發表了題為“Single cell profiling of female breast fibroadenoma reveals distinct epithelial cell compositions and therapeutic targets”的研究論文。該研究利用高通量單細胞RNA-seq分析，發現了乳腺纖維腺瘤中不同的細胞組成和上皮結構變化，證實上皮細胞可表現出激素響應功能特征，并同步激活雌激素敏感和激素抗性機制。此外，研究人員還建立了一個可擴展的患者來源的FA類器官平臺，通過對通路抑制劑進行系統探究以測試FAs的治療反應，以期為乳腺FAs提供潛在治療策略。
原文獻：Chen, Z., Zhang, Y., Li, W. et al. Single cell profiling of female breast fibroadenoma reveals distinct epithelial cell compositions and therapeutic targets. Nat Commun 14, 3469 (2023).
一、 研究背景
乳腺纖維腺瘤（FAs）是一種纖維上皮腫瘤，常見于青春期女性，長期患有會增加患乳腺癌的風險[1]。手術切除是FAs最有效的治療措施，但可能會形成不良疤痕或廣泛的導管損傷[2]。由于這類患者往往有多個病灶部位，依靠手術難以全部根除，因此迫切需要非手術的治療措施。
FAs在臨床上被認為具有激素依賴性[3]。然而，在以往的臨床試驗中，雌激素受體調節劑他莫昔芬的治療效果并不理想[4, 5]。因此，剖析人類乳腺FAs的病理機制對于開發更有效的治療方法至關重要。盡管大量測序研究已經揭示高復發FAs的突變基因并繪制出相關基因組圖譜，但由于疾病本身的復雜性以及缺乏可重復的人體模型，FAs和正常乳腺組織之間上皮細胞和基質細胞轉錄差異的潛在機制在很大程度上仍然未知。
本研究利用高通量單細胞RNA-seq分析，發現了FAs不同的細胞組成和上皮結構變化，證實上皮細胞可表現出激素響應功能特征，并同步激活雌激素敏感和激素抗性機制。此外，研究人員還建立了一個可擴展的患者來源的FA類器官平臺，通過對通路抑制劑進行系統探究以測試FAs的治療反應，以期為乳腺FAs提供潛在治療策略。
二、 研究結果
1、單細胞轉錄組分析確定了FAs的細胞組成和上皮結構特征
對4個乳腺FAs和2個配對的癌旁乳腺組織進行單細胞RNA測序（圖1a），根據不同的基因表達特征，這些細胞被劃分為10個細胞簇：成熟的管腔細胞(ML)、管腔祖細胞(LP)和基底細胞(BC)、成纖維細胞(FB)、內皮細胞(EC)、周細胞(PT)、T細胞(T)、B細胞(B)、骨髓細胞(M)以及未知細胞(Un)（圖1b）。
與正常乳腺組織相比，FAs中的基質細胞幾乎不表達激素受體，而上皮細胞則表達了高水平的激素受體。免疫組織化學染色結果證實激素受體主要在上皮細胞而非基質細胞中表達（圖2d）。成纖維細胞在FAs在基質細胞中顯著增多（圖1c），但增殖基因(MKI67、PCNA)和KI67免疫組化染色的分析顯示，成纖維細胞的增加可能不是由更高的增殖引起的。研究人員從腫瘤組織中分離出原代上皮細胞和成纖維細胞，并配對正常組織，進行上皮細胞和成纖維細胞的共培養。結果顯示正常乳腺組織中的成纖維細胞可以被FA上皮募集，證明上皮細胞在FAs形成中的重要作用。
scRNA數據顯示，與正常乳腺上皮細胞相比，FAs的上皮細胞組成中成熟管腔細胞擴大，基底細胞減少（圖1c）。研究人員基于EpCAM和CD49f的表達組合對59例新鮮FA組織及組織和21例正常乳腺組織的上皮亞群進行表征，證實了這一現象。已知正常乳腺由外層基底細胞和內腔細胞組成[6]。FAs中基底細胞的損失表明雙層結構發生了變化。這些數據表明FAs的細胞組成和結構特征與正常乳腺上皮細胞不同。
圖1
2、FAs中的上皮細胞顯示激素反應性特征
接著，研究人員對FAs上皮細胞群的功能差異進行探究。GO分析顯示FAs上皮細胞與激素反應密切相關（圖2a），基因富集顯示受雌激素和雌激素誘導基因調節的TFF1和TFF3變化最為顯著（圖2c）。
免疫熒光和免疫組織化學染色進一步證實了FAs患者中這些激素相關蛋白的表達模式（圖2d，e）。對3種不同上皮細胞類型的DEGs進行比較：（1）成熟管腔細胞上調的基因主要與激素反應信號通路相關，且管腔細胞能夠響應內分泌信號或產生乳汁[7]；（2）管腔祖細胞上調的基因主要與上皮細胞增殖相關；（3）基底細胞上調的基因主要與腺體發育的調節相關。這些結果表明FAs中的上皮細胞具有激素相應的功能特征。
圖2
3、FAs中激素敏感性和激素抵抗性共存
臨床研究顯示激素敏感性通路可以控制FAs[3, 8]。研究人員通過KEGG分析發現，除了激素敏感通路外，內分泌抵抗通路也參與其中，GSEA也提供了類似的結果（圖3a, b）。參與內分泌抵抗性通路的基因主要分為3個功能類別：ERBB2/IGF1R、CCND1和BCL2（圖3c），據報道這些基因與內分泌抵抗[9-11]及乳腺癌復發風險增加有關[12, 13]?；仡?5例術后3年內同一乳房部位復發的FAs患者和9例無復發患者的資料，結果顯示復發FAs組中ERBB2、CCND1和BCL2的表達水平顯著高于未復發組（圖3d），且與FAs復發呈正相關。此外，乳腺癌患者的ERBB2、CCND1和BCL2表達水平顯著高于FAs（圖3e）。
對內分泌抗性通路標志物是否存在于每個患者的上皮細胞進行探究。tSNE分析顯示，每位患者的上皮細胞中均能檢測到ERBB2+細胞、BCL2+細胞和CCND1+細胞。對4名FAs患者進行免疫染色，結合單細胞RNA測序以進一步驗證這些發現。結果在正常人體組織中表達水平較低的激素敏感標記物（ER、TFF1、TFF3）和內分泌抵抗標記物（ERBB2、BCL2、CCND1）在FAs患者中均被檢出，且樣本間具有顯著的異質性，提示每個受試者對內分泌治療具有不同的敏感性。這些數據表明FAs中激素敏感性和激素抵抗性共存。
圖3
4、他莫昔芬與CCND1、BCL2或ERBB2抑制劑的聯合用藥可顯著抑制了他莫昔芬耐藥FAs類器官的活力
由于激素敏感和激素耐藥途徑在FAs中共存，研究人員探索了為FAs患者提供個體化內分泌治療的可能性。對39例FA患者開發了一個可擴展的類器官平臺。這些類器官的組織學特征與原始FA上皮非常相似(圖4b)，全外顯子組測序結果顯示類器官總體上保留了人類纖維腺瘤的基因組結構（圖4c）。RNA測序顯示，相對于正常上皮，類器官和FAs之間激素敏感和激素抗性標記的轉錄變化相似（圖4d）。
與正常乳腺類器官相比，FAs類器官中激素敏感標記物和耐藥通路標記物也上調（圖4d）。GSEA還揭示了人類FAs類器官中激素敏感和激素抗性通路的陽性富集（圖4e）。FACS進一步證明，人FAs衍生類器官的上皮細胞與原始FAs具有幾乎相同的細胞組成（圖4f）。為了驗證激素響應功能特征，用10 nM雌二醇處理FA衍生的類器官，顯示ER響應的標志基因顯著上調，且刺激了類器官的生長。這些數據表明FA衍生的類器官是激素反應性的，可作為人類FAs的模型代表，用于開發個體化內分泌治療。
13例類器官的藥敏結果顯示不同患者對他莫昔芬的反應存在異質性（圖4g）。大多數類器官的IC50值要高于臨床他莫昔芬耐藥患者?；诓煌薋A衍生的類器官中他莫昔芬耐藥途徑標志物的差異表達，將他莫昔芬與CDK4/6抑制劑Palbociclib、BCL2抑制劑Venetoclax和ERBB2抑制劑lapatinib聯合，在IC10的濃度下進行藥物敏感性篩選（圖4h-j）。結果顯示他莫昔芬與CCND1、BCL2或ERBB2抑制劑的用藥組合顯著抑制了他莫昔芬耐藥FAs的生存能力，為FAs的干預提供了潛在治療方法。
圖4
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