前言
細胞是生命活動的基本單元。對細胞的精確認知是理解細胞在生理和病理過程中功能的先決條件。
在組織、器官或個體中，細胞具有非常大的異質性，而傳統的研究手段針對大量細胞進行分析，得到的是大量細胞的平均結果，無法區分不同細胞個體對于大量樣品結果的具體貢獻值，從而忽視或掩蓋了單細胞的個體差異，不能完全捕捉細胞的復雜性、多樣性以及功能的不同。
因此非常有必要開發新技術在單細胞水平揭示細胞異質性，目前對單細胞技術的需求越來越高。
PART01
二代測序技術的持續發展使對單細胞基因組和轉錄組的研究突飛猛進，科學家們對細胞認識的分辨率大大提高，然而單細胞的基因組和轉錄組數據對描述細胞在生物體復雜環境中的表型和功能還遠遠不夠，而蛋白質作為細胞內所有功能的直接執行者，細胞通過蛋白質及其翻譯后修飾，可以感知并響應幾乎所有外在和內在的刺激，從而影響整個生命體的功能和狀態。
因此，對單細胞蛋白質組的定性和定量分析，是揭示細胞類型及其狀態的必不可少工具，在腫瘤異質性、干細胞分化、生殖細胞發育、循環腫瘤細胞等重要領域有著不可或缺的應用價值。
單細胞蛋白質組學的目的就是為了實現對單個細胞內蛋白質組成的定性和定量分析，從而獲得不同細胞個體蛋白組的定性和定量差異，構建精細蛋白分子圖譜，從根本上揭示不同細胞個體之間的類型及其狀態的差異，使科研工作者可以更好地了解細胞及其表型和生命活動。
PART02
單細胞蛋白質組學技術的難點和瓶頸主要在于單細胞內極其微量的蛋白質，一般單個細胞內的蛋白質總量僅不到200 pg，而其又是由上萬種不同種類的蛋白質組成，這些蛋白質以極高的動態范圍、不同的拷貝數存在于一個單獨的細胞中。
直接對這些蛋白質進行組學鑒定分析，在其樣品前處理、分離和質譜檢測都是一種挑戰。因此受到極微量樣本制備、超高靈敏度高分辨生物質譜儀等限制，單細胞蛋白質組學分析一直都是“圣杯”一樣存在。
PART03
目前為解決單細胞極微量樣本制備的難點，科學家們開發出來一種體系是基于TMT進行標記的方法，如scope2。
Scope2研究系統主要是通過TMT的多通道優勢，將其中一個通道作為carrier cell通道，一般為20~200個細胞量的樣品，其他通道作為單細胞通道。各通道在完成TMT標記后進行混合上機檢測。
采用carrier cell通道的優點有如下幾點，第一、可以有效補償單細胞樣品在后續分析中的損失；第二、其對蛋白質的定性可以使用含量更高的carrier cell通道中的MS/MS，而借助TMT各通道報告離子進行定量；第三、大大提高單細胞檢測的通量。
基于scope2技術的單細胞蛋白質組學分析流程
https://doi: 10.1186/s13059-021-02267-5
除此之外，還有研究者采用基于液滴的樣品前處理系統，如nanoPOTS、gOAD、nested nanoPOTS(N2) chip和proteoCHIP系統，這類系統主要優點有：1）液滴體積小可以減少與管壁接觸轉移帶來的樣品損失問題；2）小體積液滴與單細胞樣品兼容性更好，具有更高的酶切反應速率。但也有其不足之處，比如該液滴操作系統需要在具備相關操作能力的實驗室開展，還需開發適用于液滴體系上樣的新技術。
基于液滴體系的樣品前處理和離心處理上樣系統proteoCHIP的工作流程
https://doi.org/10.1101/2021.02.17.431689
其中在N2 chip和proteoCHIP系統中結合了微流控液滴和TMT標記的技術，可進一步提高單細胞分析的檢測通量和定量蛋白質數目。
此外，還有一類是結合超高靈敏度質譜儀timsTOF和DIA采集模式，在前處理過程中縮小反應體系到2ul左右以此減少樣品損失，實現單細胞的蛋白質組學分析。
基于液滴體系的樣品前處理和液滴自動進樣器的N2系統工作流程
https://doi.org/10.1101/2021.04.14.439828
基于Evosep和timsTOF-DIA聯用的單細胞樣品前處理系統
https://doi.org/10.1101/2020.12.22.423933
PART04
通過單細胞蛋白質組學分析可以根據差異蛋白質信息來區分不同腫瘤細胞的分子分型，相較于傳統的病理組織分析技術更加精細準確，對于理解疾病的發生發展具有重要的意義。
另外，一些生物學樣品由于稀少，單細胞技術是唯一可以對其進行研究的技術。例如在胚胎發育早期階段少量個數的細胞、在神經生物學領域越來越得到重視的單個神經元以及數量稀少的循環腫瘤細胞等，傳統蛋白組學技術無法獲得這類樣品的蛋白質組學數據，因此單細胞蛋白質組將是必要的手段，對于組織亞結構研究、胚胎發育、腫瘤異質性、CTC細胞、干細胞分化和神經研究提供重要的生物學意義。