酵母雙雜交由Fields和Song在1989年提出. 他的產生是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。酵母雙雜交就是基因轉錄所需的轉錄因子的兩個結構域在兩個互作蛋白的吸引下位置靠近，誘導了基因的表達。
酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點： ⑴ 作用信號是在融合基因表達后， 在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。⑵ 檢測在活細胞內進行， 可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應， 因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。⑷酵母雙雜交系統可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫， 能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。
酵母雙雜交系統是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，但仍存在一些問題有待解決。
酵母雙雜交系統應用中常遇到的問題之一是假陽性較多。所謂假陽性就是：在待研究的兩個蛋白間沒有發生相互作用的情況下，報告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，則也可單獨激活報告基因的表達。因此，為排除假陽性就需要作嚴格的對照試驗。應對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前酵母雙雜系統都采用了多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區各不相同，這可減少大量的假陽性。另外，報告基因通常整合到染色體上，可以使基因表達水平穩定，消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。
在酵母雙雜交的應用中有時也會遇到假陰性現象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應發生相互作用，但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來。造成假陰性的原因主要有兩方面：一是融合蛋白的表達對細胞有毒性。這時應該選擇敏感性低的菌株或拷貝數低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現象雖不是實驗中的主要問題，但也應予以重視。
轉化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉化效率。轉化時可采用共轉化或依次轉化，相比之下共轉化省時省力。更重要的是如果單獨轉化會發生融合表達蛋白對酵母細胞的毒性時，共轉化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉入不同接合型的單倍體酵母中，通過兩種接合型單倍體細胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細胞。
近年來，還有許多研究者對雙雜交系統進行了改進和發展。例如采用假陽性顯示分析法和雙篩選系統以減少"假陽性"的發生；發展哺乳動物雙雜交系統更好地研究蛋白間的相互作用。其中雙篩選系統用二種不同的報告基因（常用lacZ和HIS3）有以下優勢：用不同的啟動子表達位于酵母二個染色體上的報告基因，可明顯減少假陽性。通過營養型篩選增強了篩選能力，尤其適用于對較大的庫容量而被選蛋白較少情況下的篩選。
酵母雙雜交系統是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內蛋白質相互作用，對蛋白質之間微弱的、瞬間作用也能夠通過報告基因的表達產物敏感地檢測得到。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術在發現新的蛋白質和蛋白質的新功能、研究抗原和抗體相互作用、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應用廣泛。隨著對酵母雙雜交技術的研究深入和不斷優化，酵母雙雜交技術與其它技術結合，將更有利于對實驗結果作出更為完整和準確的判斷。