作者：鄭旺博士
膠質母細胞瘤（GBM）是世界衛生組織四級腦部惡性腦腫瘤，是最致命的人類癌癥之一，多呈浸潤性成長，外科手術很難做到真正的完全切除，而放射治療可有效殺滅或者抑制殘余的腫瘤細胞，因此目前臨床上將術后聯合放化療作為神經膠質瘤的標準治療方案。然而，大量報道證實GBM對電離輻射并不敏感，這也是限制患者生存率的最重要因素之一。就惡性腫瘤而言，自噬介導的細胞內分解代謝作為腫瘤對輔助放射治療等治療反應的促進生存過程。因此，自噬被認為是一種適應性機制，導致腫瘤獲得對治療的抗性。因而，深入開展GBM放療耐受的調控基因及主要機制的研究，不僅可以從細胞及分子水平系統揭示輻射耐受的深層機理，更能通過靶向調控這些關鍵的基因或蛋白，提高臨床神經膠質瘤患者放療的療效，有效改善患者預后。2022年8月1日，復旦大學放射醫學研究所邵春林教授團隊在《Autophagy》（2022 IF：13.391）上發表題為“SDC1-dependent TGM2 determines radiosensitivity in glioblastoma by coordinating EPG5-mediated fusion of autophagosomes with lysosomes”的研究論文，該研究揭示了膠質母細胞瘤中轉谷氨酰胺酶TGM2通過多配體聚糖SDC1依賴的方式轉運至溶酶體，促進束縛因子EPG5介導的自噬體-溶酶體融合，最終增強腫瘤的輻射抵抗，為膠質母細胞瘤放療提供新的潛在增敏靶點。吉凱基因提供了本研究中的TMT蛋白質組學分析以及質粒構建服務。
1. 自噬活動在輻射抗性的GBM細胞中增強
研究者通過多階段的X射線處理GBM U251細胞系獲得了輻射抗性的細胞系U251R，但仍低于T98G的輻射抗性。隨后，研究者檢測了輻射抗性細胞中的自噬活動。結果表明，在輻射抗性的GBM細胞系中，輻射誘導的自噬溶酶體形成被顯著增強，而抑制自噬則增強了GBM細胞對放射的敏感性。這些結果表明，GBM細胞的輻射抗性與自噬活動增強有關。
2. 蛋白質組學發現輻射抗性細胞中的差異蛋白
為了尋找在參與GBM輻射抗性的關鍵基因，研究者使用TMT蛋白質組學對U251、U251R，和T98G細胞進行蛋白表達譜檢測（蛋白質組學技術服務由吉凱基因提供），并通過U251R比U251、 T98G比U251 和 T98G比U251R尋找差異蛋白。研究者重點關注了可能成為治療靶點的上調蛋白。三個比較共有的上調蛋白有17個，在這其中，SDC1和TGM2同時在GBM患者中高表達，且這兩個基因與差的預后相關。免疫組化染色也表明，SDC1和TGM2在對放療不敏感的GBM組織中上調。因此，研究者將重點放到了這兩個基因上。蛋白-蛋白相互作用分析表明這兩個蛋白不直接關聯，而臨床相關的分析上，這兩個蛋白的存在共表達關系。綜合以上分析表明，SDC1和TGM2在輻射抗性的GBM細胞和組織中的高表達與腫瘤發展和差的預后有關。
3. SDC1和TGM2通過促進自噬體的成熟增強細胞的輻射抗性及自噬
進一步，研究者檢測了SDC1和TGM2在轉錄和蛋白水平的表達，并發現它們在U251、U251R和T98G細胞中有序增加，即與輻射抗性呈正相關。當在細胞中干擾SDC1和TGM2的表達后，暴露于X射線的U251R和T98G細胞的存活顯著降低，這表明SDC1和TGM2有助于GBM細胞的輻射抗性。
隨后，研究者檢測了SDC1和TGM2調控的輻射敏感性和自噬活性的關系。KEGG富集分析顯示，SDC1和TGM2均參與自噬調控的途徑。而當GBM細胞中的SDC1或TGM2被干擾時（siSDC1和siTGM2），在輻射后，細胞中的自噬體形成減少、LC3 II:I升高、SQSTM1降解減少，這表明自噬體成熟過程被封閉。重要的是，研究者發現SDC1和TGM2的互作促進了GBM細胞中自噬體和溶酶體的融合過程。
4. SDC1啟動輻射后TGM2從細胞膜到溶酶體的轉位
為了進一步理解SDC1和TGM2是如何誘導自噬體的成熟，研究者檢測了GBM細胞中SDC1和TGM2的亞細胞定位。免疫熒光染色表明，在未輻射下，SDC1蛋白主要定位在細胞膜上，而TGM2一部分與SDC1定位在細胞膜上，一部分則定位在細胞核內。在4Gy輻射12h內，尤其是6h時，細胞膜上的SDC1和TGM2顯著減少，而細胞漿中的SDC1和TGM2則增加。研究者排除了細胞漿中TGM2來自于細胞核的可能性。隨后，研究者探究了是SDC1、TGM2還是其他蛋白啟動了這種細胞漿轉運。結果表明，抑制大型胞飲作用（macropinocytosis）或干擾SDC1均可以減弱輻射后SDC1和TGM2在細胞漿中的增加。進一步地，研究者通過CO-IP實驗明確了SDC1和TGM2的強結合作用。隨后，研究者通過表達不同結構域缺失的SDC1（質粒產品由吉凱基因提供），明確了在GBM細胞中，SDC1通過它的胞漿結構域轉運TGM2至溶酶體，參與輻射誘導的自噬體成熟。
5. TGM2-LC3相互作用促進自噬體對EPG5的捕獲以及含STX17的QabcR SNARE復合體的組裝
研究者進一步檢測了SDC1和TGM2直接結合LC3的可能性。TGM2上有兩個潛在的結合LC3的結構域——WLTL和FILL，而SDC1沒有。研究表明，TGM2利用其自身兩個LC3相互作用區與自噬體LC3結合，促進定位于溶酶體的束縛因子EPG5與LC3結合，進而捕獲自噬體并招募裝配QabcR SNARE復合體（VAMP8-STX17-SNAP29），最終自噬溶酶體形成，腫瘤輻射抵抗增加。
6. 放療（RT）和Cys-D聯用可以改善GBM荷瘤小鼠的生存和病理響應
在探究完SDC1和TGM2促進GBM輻射抗性的機制后，研究者想知道一個TGM2抑制劑cystamine dihydrochloride（Cys-D）對GBM輻射敏感性的作用。Cys-D處理可以有效抑制TGM2的表達、顯著提升U251R和T98G細胞的輻射敏感性。研究者構建了U251R細胞的異種原位移植瘤小鼠模型，并發現單用Cys-D治療可以將荷瘤小鼠的中位生存時間從26天延長至32（無統計學顯著性），而單獨使用放射治療（RT）可以將中位生存時間延長至44天。聯合使用Cys-D和RT后，60%的小鼠在60天時仍然存活。與對照組和單一治療組相比，聯合治療組的小鼠在15天和30天時的腫瘤體積顯著減小，存活60天的聯合治療小鼠的腦部腫瘤得到有效清除。此外，聯合治療的小鼠體重增加，而對照組及單一治療組的小鼠隨著腫瘤的進展出現營養不良和惡病質。以上結果表明，TGM2抑制劑和放射治療聯合使用可作為GBM的潛在治療選擇。
本研究細胞蛋白組學（吉凱基因提供）和臨床病理切片分析，發現SDC1與TGM2是兩個協同促進膠質母細胞瘤輻射抵抗的生物標記物，抑制SDC1與TGM2蛋白表達水平顯著的增強了GBM細胞的輻射敏感性。進一步研究發現，細胞自噬水平在GBM的輻射抵抗發生發展中發揮了重要作用，而SDC1與TGM2可以通過調控自噬進程中關鍵“清道夫”—自噬溶酶體的形成，介導細胞的輻射抵抗。機制研究表明，腫瘤受輻射后，細胞表面的SDC1發生內化，攜帶TGM2轉運至溶酶體，TGM2利用其自身兩個LC3相互作用區與自噬體LC3結合，促進定位于溶酶體的束縛因子EPG5與LC3結合，進而捕獲自噬體并招募裝配QabcR SNARE復合體（VAMP8-STX17-SNAP29），最終自噬溶酶體形成，腫瘤輻射抵抗增加。臨床轉化研究方面，該團隊發現給予口服TGM2抑制劑胱胺二/鹽/酸/鹽可顯著提高原位移植腫瘤的放療緩解效果，有效延長小鼠生存期。
吉凱助力
吉凱基因提供了本研究中的TMT蛋白質組學分析以及質粒構建服務。
作者簡介
復旦大學放射醫學研究所邵春林教授為該論文的首要通訊作者，副研究員張江虹和潘燕為共同通訊作者，博士研究生鄭旺和陳倩萍為論文的共同第一作者。該研究獲得了國家自然基金、上海市科技計劃項目等的資助。
左三：邵春林教授；右三：鄭旺博士；左二：陳倩萍博士
邵春林教授課題組
吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務領域的技術積累，建立的標準化 、工程化 、系統化的GRP平臺，為中國研究型醫生提供科研服務，加快科研成果轉化。其中，多組學平臺包含蛋白質組學平臺和高通量測序平臺：
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務