編者按

藥理學與毒理學隸屬于更宏大的化學與生物學關聯性研究體系，盡管生物醫學聚焦于與人類直接相關的特定案例，但采用系統化方法表征小分子及其他干預措施如何影響健康與疾病，具有顯著的優勢。斑馬魚作為可高通量篩選的代表性脊椎動物模型，結合基因組編輯和自動化表型分析技術，正推動著系統藥理學與毒理學的發展。

今天，我們分享由哈佛大學醫學院附屬布列根和婦女醫院等研究團隊聯合在在Annual Review of Pharmacology and Toxicology（IF=11.2）上發表的綜述性文章。該研究聚焦斑馬魚在藥理學與毒理學的最新進展，探討了斑馬魚在新藥研發、毒性預測及環境毒理中的應用，并構建了系統性的藥理學與毒理學體系，強調了通過多維度表型錨定和深度學習整合優化藥物-疾病相互作用的潛力。

文章題目

Zebrafish as a Mainstream Model for In Vivo Systems Pharmacology and Toxicology

雜志：Annual Review of Pharmacology and Toxicology（IF=11.2）發表時間：2022年9月23日作者：Calum A. MacRae and Randall T. Peterson

單位：哈佛大學醫學院附屬布列根和婦女醫院、猶他大學藥學院

DOI: 10.1146/annurev-pharmtox-051421-105617

01、研究亮點

• 確立斑馬魚為藥理學、毒理學研究的黃金標準模型；

• 通過跨物種保守機制進行轉化醫學驗證，并對心毒性、神經毒性、環境毒性進行精準預測，加速了臨床轉化周期，解析了多器官協同毒性網絡；

• 通過交叉技術創新，構建了閉環深度學習驅動的系統毒理平臺，推動藥理學研究范式向動態化、數字化、可預測化演進。

02、研究背景

人類疾病治療很大程度上源于基因與小分子的相互作用。人類疾病的復雜性使現代藥物開發常常面臨著疾病生物學表征受限、臨床前缺乏系統性的數據、臨床醫學的分辨率滯后等諸多挑戰，導致臨床實驗失敗率較高。近二十年來，斑馬魚作為可高通量篩選的代表性脊椎動物模型，成為藥物研發領域不可或缺的工具。

基因編輯技術、合成生物、實驗室自動化及深度學習的發展，使數十萬小分子化合物的生物活性篩選成為可能。一旦治療靶點被確定并驗證，基于靶點結合或進行高通量篩選（HTS） 就可以高效地生成調控靶點蛋白活性的新結構。模塊化學、單克隆抗體、納米抗體、小干擾RNA及基因編輯等可重復的新型平臺，使靶點識別成為藥物發現的重要因素。

即使是最具代表性的體外檢測方法，也難以模擬疾病的復雜效應及其與治療干預的相互作用。體外檢測很少能全面重現靶點的全部功能，也無法揭示潛在的藥物毒性脫靶位點。這種表征缺失推動了互補性表型的開發，不斷涌現的能進行高通量測序的類器官或體內動物模型，被用于探索疾病通路、藥物發現及毒理學研究等。

動物模型被廣泛用于藥物研發，但很少被用于新藥的先導化合物篩選。斑馬魚作為唯一可用于高通量篩選的脊椎動物，可進行大型小分子庫或大量基因的系統性篩選，以用于識別復雜的疾病表型抑制劑或靶向/脫靶毒性。

過去十年中，斑馬魚已成為藥理學、毒理學研究的成熟工具。基因組修飾與表型分析上的創新已逐步提升了基因功能注釋、疾病靶點識別與驗證、體內化學篩選的規模等，不斷提高的自動化技術和新興的現代化分析方法，為藥理學和毒理學的研究提供了廣闊的前景。

03、研究結果

1. 斑馬魚常用技術及工具

目前，已開發了數千種斑馬魚疾病模型。斑馬魚與人類基因高度同源，在遺傳學、病理生理學、藥理學及毒理學等方面與哺乳動物相似。斑馬魚養殖、疾病模型構建及表型分析的新工具、新技術，使得大規模、更全面的篩選成為可能。

（1）基因型錨定斑馬魚的基因組特性，使其成為探索遺傳機制及基因-小分子相互作用的強大工具。對遺傳疾病而言，關鍵的第一步是構建真實人類突變等位基因的模型?；蚓庉嫻ぞ呤咕_建模多數等位基因變得更加容易，斑馬魚基因編輯技術可以模擬大規模的結構遺傳效應，系統性地解析多個基因位點。隨著技術的進步，以并行方式對大量基因進行可擴展建模越來越可行。

利用納米微滴技術與DNA條形碼技術，可將基因編輯工具應用于全基因組探究；通過靶向誘導基因組局部損傷技術，可捕獲錯義變異；若無相關等位基因，則可在限制條件下使用同源重組的方法。在斑馬魚中，體細胞基因編輯、譜系追蹤已應用廣泛，可用于理解腫瘤形成過程及其他相關疾?。灰部梢栽诎唏R魚中開展微生物組的遺傳學研究。

（2）表型與表型錨定斑馬魚基因的操作便捷性，推動了跨生理表型的基因功能注釋，通過分析數百個基因的單一表型，或利用已知的遺傳實驗數據，對基因組中具有相同表型的基因進行排序。表型分析工具不僅可以發揮斑馬魚的建模潛力，也正在改變體內篩選的范圍。

在藥物發現和研發中，斑馬魚是最佳的高通量脊椎動物。能用于高通量測序的表型對充分發揮斑馬魚的潛力至關重要，但必須確保這些表型與相應的人類特征保持一致。利用多孔板開展斑馬魚研究時，在受精后4-5天效果最佳。斑馬魚生命最初幾天的動態變化，需要在表型建立和驗證中予以考量。盡管這一過程被高度壓縮，但往往直接反映了人類發育過程中的相同序列?，F有數據還表明，這種發育過程使建立斑馬魚模型來高通量篩選研究人類成年期的疾病成為可能。

單細胞RNA測序正變革跨模型至人類的細胞表型映射能力；染色質轉座酶可及性高通量測序技術（ATACseq）、DNase I超敏感位點作圖及表觀基因組學、代謝組學、脂質組學等工具也已在斑馬魚中廣泛應用。這些技術交叉融合，使分子與細胞生物學的全息四維表征更接近現實。

（3）新興的表型工具過去幾年已出現更自動化的綜合表型分析策略。自動化高通量斑馬魚胚胎分選儀，或將斑馬魚胚胎吸入玻璃柱以進行3D表型分析的機器人裝置，在特定場景中是成功的，但受限于處理量，且增加了表型分析時的約束性；單細胞分辨率的斑馬魚表型分析儀，有望提升建模水平；斑馬魚篩選的未來還包括全自動延時顯微鏡和機器學習訓練表型等。這些技術正被用于藥物發現和毒理學應用研究。

這些新興工具使斑馬魚能實現多維表型分析，有助于揭示大量小分子化合物的活性差異，也凸顯了全面的表型分析與藥物響應對系統理解基因-環境關系的影響。

2. 斑馬魚體內篩選在藥物發現中的應用

在利用斑馬魚進行藥物發現或毒理學研究中，一個核心問題是所觀察到的生物學表現能在多大程度上表征人類疾病和藥物反應。在最初的斑馬魚篩選中鑒定出在器官發育中具有特定作用的基因，在小鼠或人類中驗證結果一致。斑馬魚與人類基因發現常同步發生，暴露于小分子庫中時，斑馬魚對化合物的反應與人類的反應存在很強的相關性。

利用斑馬魚篩選復雜表型時的有效命中率，顯著高于單一細胞環境中單一分子靶點高通量篩選的有效命中率，這揭示了靶向多通路并行的效用，表明通路規范化策略，而非對單一信號進行更簡單的二元修飾，可能為疾病治療帶來顯著的優勢。在多個靶點之間進行通路修飾是許多藥物成功的特性，可能代表著療效與毒性間的平衡?？梢栽隗w內通過設計優化藥物-疾病相互作用的平衡，是斑馬魚模型的獨特優勢。斑馬魚篩選發現的眾多化合物已進入開發階段，并逐漸走向臨床。

使用斑馬魚篩網的另一種可推廣的方法是重新利用現有的化合物。在斑馬魚中發現了刺激造血干細胞增殖的化合物，發現前列腺素E2(PGE2)是這種現象的有效驅動因素109)。鑒于先前人類在PGE2方面的經驗，可以在從即將接受骨移植的癌癥患者中提取的干細胞中快速測試這一假設是可行的。

另一通用策略是利用斑馬魚來重新篩選現有的化合物。在斑馬魚中發現了刺激造血干細胞增殖的化合物，發現前列腺素E2（PGE2）是該現象的高效驅動劑。

3. 利用斑馬魚篩選來識別化合物毒性及其緩解作用

利用斑馬魚篩選方法也可用于識別對化學毒素的緩解作用，解析小分子藥物的的治療與毒性效應。蒽環類心臟毒性抑制劑篩選中發現的小分子visnagin已成功應用。研究人員首先在斑馬魚中建立了毒性綜合征模型，并通過與現有的小鼠模型進行比對加以驗證。初篩后鑒定出visnagin，其可以抑制阿霉素的心臟毒性但不削弱該藥物對細胞增殖的影響。通過系統性的方法識別靶點，揭示了Cypl抑制作用是visnagin的作用機制。目前，該先導化合物及其他靶向Cyp1的化合物正在開發中。

類似的案例還有減輕氨基糖苷類抗生素引起的耳毒性。氨基糖苷類抗生素及某些抗腫瘤藥誘導的毛細胞死亡和聽力損失是一個嚴重的臨床問題。Owens等開發了氨基糖苷誘導側線毛細胞損失的斑馬魚模型，篩選出能夠預防毛細胞損失的基因突變和小分子化合物。他們發現，多個基因在氨基糖苷類抗生素暴露后能夠調節毛細胞的存活，還發現了一類耳保護性苯并噻吩羧酰胺化合物，這些化合物不僅在斑馬魚側線，也能在培養成年鼠橢圓囊中預防氨基糖苷類抗生素引起的毛細胞死亡。這項斑馬魚實驗還推動了結構-活性關系研究，以優化噻吩羧酰胺類化合物，并篩選出在大鼠模型中具有改善藥物性質和耳保護作用的化合物。

利用斑馬魚還發現了緩解代謝毒物氰化物相關毒性的化合物。氰化物常通過煙霧吸入、工業事故、故意投毒及含氰化物的食物而威脅人類健康，其也被視為高危毒素，甚至可能用于化學恐怖襲擊。雖然已有氰化物的解毒劑存在，但其應用范圍有限，因為需要通過靜脈注射來給藥，在大規模傷亡事件中受限較多。斑馬魚氰化物毒性模型已被用于篩選超10萬種小分子，發現兩類有前景的氰化物對抗劑類別。鉑類化合物六氯鉑酸鹽和乳酸脫氫酶底物乙醛酸，不僅在斑馬魚，也在小鼠、兔和豬中被證明可以高效預防氰化物誘導的毒性及死亡，而且這兩類化合物均可肌注給藥，正進一步開發用于氰化物暴露者的現場救治。

4. 斑馬魚在毒理學研究中的應用

斑馬魚中全面呈現的潛在靶點/脫靶毒性，是任何生物體毒理學應用的核心。斑馬魚為多種不同毒性提供了獨特見解，并由于其特性，成為了研究毒性的理想模型。其高通量優勢可以在藥物開發的不同階段，與其他臨床前評價模型互補。斑馬魚的雜合特性，又使其成為復雜毒理學中的核心組成部分。

（1）器官與系統特異性毒性過去二十年，斑馬魚已被證明可用于研究多個器官和系統相關的毒性，以及致畸性、心臟毒性、肝毒性、腎毒性、神經毒性、胃腸道毒性、肌肉毒性和致癌性等。因這些器官系統特異性毒性已有廣泛綜述，我們在這里只聚焦三個重點領域——心臟毒性、神經毒性和致癌性。

（2）心臟毒性心臟復雜異常，癌癥一線化療藥物常通過DNA損傷和氧化應激等機制，誘發心律失常，導致心臟毒性，威脅著患者的心臟健康。斑馬魚是研究藥物毒性、注釋小分子功能和在遺傳疾病模型中發現經驗通路的工具，因此，已有一些研究探討了斑馬魚在預測心臟毒性方面的效用。

利用簡單的心率反應，可以建立與已知的成人復極化心臟毒性的極好相關性，并概括臨床相關的藥物相互作用。采用鈣成像和光學電壓映射方法，能夠以高分辨率對心肌電生理進行表征，其水平與當前最先進的犬或免模型相當，且很容易在存在QT間期延長藥物、已知離子通道突變或新近被認為與心臟復極有關的基因的情況下確定動作電位延長的現象。已有研究觀察了人類復極化障礙的特征，如動作電位時程的三角化或延長，以及特定的心律失常觸發因素，包括自發早期后除極。通過使用特定的Ikr阻斷劑多非利特對復極化儲備進行研究，進一步增強了斑馬魚模型的可靠性。重現在體外無法實現的典型多器官相互作用，是斑馬魚模型的重要優勢。

此外，利用斑馬魚也篩選鑒定出抑制hERG通道遺傳或化學阻斷表型的化合物；斑馬魚在心臟毒性機制研究中也被證明是有用的。斑馬魚實驗結果表面，現代抗癌藥，如酪氨酸激酶抑制劑、免疫檢查點抑制劑及更經典化療藥等均可致心臟毒性。

綜上，心臟毒性的研究成果有力地證實了斑馬魚和人類在多層面具有廣泛同源性，并為基于斑馬魚篩選技術的抗心臟毒性藥物的開發奠定了基礎。

（3）神經毒性神經毒性是藥物不良反應之一，尤其在抗腫瘤藥物中發生率可高達30%~40%。藥物神經毒性的癥狀包括頭暈、嘔吐、癲癇和感覺失常等，有些藥物可能造成對神經元的不可逆損傷，因此對于藥物神經毒性開展研究十分必要。但目前預測神經毒性及其他不良神經效應仍存在諸多挑戰，現有的常規模型不足以充分反映藥物對人類情緒、覺醒、認知等神經狀態的影響，且哺乳動物模型常昂貴、費力，因此在藥物發現的早期階段，如藥物篩選和優化先導化合物時很少被采用，而在這個階段，本可避免選擇有問題的先導化合物。

斑馬魚可以通過多種途徑應對這些挑戰。由于斑馬魚在早期生命階段是透明的，很容易觀察到其腦部形態的變化；通過使用熒光染色或轉基因品系，可以實時監測瀕死的神經元，這些方法可用于快速篩選神經毒性化合物。

斑馬魚為觀察和精確量化化合物誘導的行為變化提供了新途徑。已開發多種行為測試方法，能夠從數百到數萬個化合物中自動量化斑馬魚行為。此類評估的行為表型包括光線和聲音反應、社交偏好、睡眠、威脅響應、前脈沖抑制、攝食及阿片類自我給藥等。每一種檢測方法都能分別識別具有不良行為效應的化合物，但通過將多種方法組合，并利用定量結果構建每種被篩選化合物的多維行為條形碼，可以作為詳細的定量描述符，用以表征化合物對多種行為方面的效應，且不同化合物的條形碼可以通過數學方法進行對比。

最后，斑馬魚腦部活動成像的工具有望揭示其腦神經毒性?；顒又械陌唏R魚鈣成像提供了透明的斑馬魚腦功能的視圖，磷酸化ERK染色等技術也已用于大規模篩選時捕捉腦部功能的瞬間狀態。

（4）致癌性目前已開發多種斑馬魚腫瘤模型，旨在利用斑馬魚推動遺傳和化合物的大規模篩選。此外，斑馬魚還被用于體內致癌性測試。20多年來，研究人員一直在將斑馬魚用以替代小鼠和鱒魚，顯著減少了所需的試驗化合物和組織學樣本量，并展示了其在多種組織中能高效檢測腫瘤的能力。

斑馬魚還揭示了腫瘤發生的機制，這是通過在不同敏感菌株中開發染色體損傷報告基因，或通過基于下一代測序技術的全面染色體破壞檢測來實現的。斑馬魚使研究者能夠捕捉到完整的代謝物譜、器官特異性毒性及基因修飾物等其他生物學上的細微差別，其規模效率接近細胞培養水平。

（5）吸收、分布、代謝和排泄表征斑馬魚的吸收、分布、代謝和排泄（ADME）仍是技術挑戰。盡管如此，該生物體已重現多種經典ADME依賴性藥物的相互作用，但將相關過程擴展至處理一系列衍生物及更多小分子，仍然很困難。利用質譜技術進行跨物種比較研究，證明了數十至數百種化合物研究的可行性，并支持現有斑馬魚數據的嚴謹性。

大多數小分子物質的理化特性可以被用來預測其吸收情況，而這些特性與藥物成功的特性相關。幼魚從水介質跨膜吸收小分子物質，其吸收過程受pH值和緩沖能力的影響，因此，監測代謝狀態對獲得成功的結果至關重要。低通量下，利用熒光或氚標記化合物測量藥物吸收和分布可行；若無法采用，可采用標準的生物分析技術用于斑馬魚，并結合基于熒光報告基因的組織/器官分選?，F代液相色譜-串聯質譜技術及其他無偏技術也證明是有用的；更高分辨率的代謝組學工具及更特異性的活體報告染料和轉基因工具，也將加速斑馬魚藥物及其代謝物的ADME研究。

5. 斑馬魚用于環境毒理學研究

環境中有超過10,000種化合物，識別其暴露風險是一項艱巨的任務。接觸化合物是導致人類疾病的一個重要因素，但表征和理解這種“暴露組學”的影響仍然是生物醫學研究面臨的重大挑戰。斑馬魚模型能夠一次性暴露于數千種化合物，并結合深度多系統表型分析，似乎是應對“暴露組學”影響的最有前景的方法之一。

近期的多項研究通過系統性暴露于化合物或納米材料中，通過一系列形態學、生理學和行為學測試進行表征。這些初始篩選中，斑馬魚數據與既往哺乳類毒理學數據的相關性總體一致，但存在一些生物學相關的差異。

雖然系統性地篩查環境化學品旨在評估一系列多樣的形態學、生理學和行為學表型的影響，但有些篩查聚焦于特定的表型，如社交缺陷。社交能力的降低是自閉癥的顯著特征，雖然許多基因變異與自閉癥有關，但約40%的自閉癥風險是由環境因素所致，而大部分原因尚不明確。為了識別可能增加自閉癥風險的某些環境化學品，已有研究開發了定制篩選平臺，用于約20天評估斑馬魚的社交偏好。

該平臺可實現每天對數百條斑馬魚進行自動化評估，但并未針對化學物質的急性效應進行篩選。經過篩選1120種經過臨床批準的藥物中，氟諾酮類抗生素被確定為對社會發育具有顯著干擾作用的藥物。進一步的研究表明，這種作用是通過拓撲異構酶2a和Polvcomb抑制復合體2介導的，并且在齒類動物中表現出相似的效果。這項研究展示了斑馬魚篩選系統在揭示環境化學物質與人類疾病之間潛在關聯方面的潛力。

04、編者點評

      藥理學與毒理學致力于解析化學與生物學的關聯。斑馬魚作為可規?；Y選的脊椎動物模型，結合基因組編輯和自動化表型分析技術，正推動系統藥理學/毒理學發展。本綜述探討了其在新藥研發、毒性預測及環境毒理中的應用，對基因-藥物、藥物-藥物以及藥物-環境交互作用進行了系統性探索，揭示了斑馬魚是此類工作最有價值的平臺之一。

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！