非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是全球慢性肝病的主要原因，然而，目前還沒有治療方法或藥物能夠阻止或逆轉脂肪肝。隨著病情的進展，患者會出現不可逆肝損傷，甚至可能需要肝移植。由于缺乏研究模型，NAFLD防治方法的研究面臨很大挑戰。
今天我們特別關注一篇在NAFLD領域的最新研究成果——《Engineered human hepatocyte organoids enable CRISPR-based target discovery and drug screening for steatosis》，該研究團隊通過多種技術手段構建了NAFLD類器官模型來研究NAFLD進展的不同因素，并且成功發現FADS2基因是一個新的與NAFLD相關的關鍵基因，為后續治療提供了一個新的起點。
一、研究背景
全球約有1/4的人口深受非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）影響[1]。NAFLD是一種進行性疾病。從肝臟內脂肪堆積開始，即肝臟脂肪變性，可發展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH），最終導致肝衰竭或癌癥[2,3]。盡管NAFLD的患病率很高，并且還在不斷上升，但任何階段的NAFLD都缺乏有效的藥物治療[4,5]。
在已有的研究中，NAFLD生物學和假定的藥物治療主要以嚙齒類動物為模型進行研究[6]。但固有的物種間差異，削弱了研究結果與人體的對應性。依賴原代細胞或多能干細胞衍生細胞的相關體外人NAFLD模型已經出現[7-9]，但其對高通量藥物篩選的適用性仍未得到證實。本文使用人胎兒肝細胞構建類器官模型，在此模型的基礎上建立了基于CRISPR的篩選平臺，稱為FatTracer，并且成功篩選到關鍵的靶點FADS2基因，有助于更好的了解以及治療NAFLD。
二、主要研究結果
1. 建立類器官疾病模型模擬不同機制的脂肪變性
構建三種不同肝臟類器官以模擬不同的脂肪變性觸發因素，分別是：（1）游離脂肪酸（FFA）誘導的脂肪變性類器官模型，用以研究飲食導致的脂肪變性；（2）編輯PNPLA3基因誘導的個體遺傳敏感性類器官模型，用以研究個體遺傳敏感性差異導致的脂肪變性；（3）編輯APOB或MTTP基因誘導的脂質代謝障礙類器官模型，用以研究脂質代謝障礙所致的脂肪變性。
（1）添加低濃度的FFA（＜80 μM），類器官能夠正常代謝，不會形成甘油三酯沉積，添加較高濃度FFA（＞80 μM），類器官中出現甘油三酯積累，提示出現脂肪變性。最高濃度FFA添加后（640 μM），統計類器官的脂肪變性比率約40%，且類器官的增殖能力受損；
（2）PNPLA3基因中編碼I148M變異的rs738409變異是已見報道的與NAFLD相關性最強的遺傳風險因素[10]。作者利用CRISPR方法在類器官中引入I148M變體，生成雜合子（PNPLA3WT/I148M）和純合子（PNPLA3I148M/I148M）變體類器官，同時使用引入空載體但未編輯的類器官（PNPLA3WT）作為內部對照，還對PNPLA3進行了敲除（PNPLA3?/?）。 PNPLA3WT類器官在標準培養條件下不會出現脂肪沉積。但是三個編輯過PNPLA3基因型的類器官都自發產生了脂肪沉積。PNPLA3?/?類器官積累脂肪最多（約8%脂肪變性），其次是I148M純合子類器官（約5%）和雜合子I148M類器官（約2%）；
（3）建立兩種易導致NAFLD的單基因脂質疾病模型：家族性低β脂蛋白血癥和無β脂蛋白血癥。這些疾病最常見的原因單等位基因或更罕見的雙等位基因缺失（家族性低β脂蛋白血癥缺失APOB，無β脂蛋白血癥缺失MTTP），由此產生的極低密度脂蛋白（VLDL）分泌受損，反過來又會導致脂肪變性。作者首先證實野生型類器官主動分泌VLDL顆粒，從而不會積累起甘油三酯。然后，作者對野生型類器官進行基因編輯，構建了APOB和MTTP雙等位基因缺失的類器官模型，通過脂質含量的定量、葡萄糖同位素示蹤實驗，表明由于糖源性脂肪的積累，肝臟類器官自發出現脂肪沉積，導致脂肪變性，成功構建了遺傳性脂肪變性肝臟類器官。
圖1 構建不同機制的肝臟類器官模型
圖2 建立脂質代謝障礙類器官模型并探究機制
2. 篩選通過減少脂肪變性治療NAFLD的藥物
上述開發的模型可以搭建藥物篩選平臺，以識別直接作用于肝細胞以減少脂肪變性、治療NAFLD的藥物。作者將FFA誘導的模型和脂質代謝障礙模型暴露在多種候選藥物中，通過尼羅紅染色評估脂肪沉積，開發出脂滴評分系統來評價藥物有效性。并對遺傳易感性模型添加FFA，誘導飲食導致的脂肪變性模型，再利用篩選出的幾種有治療效果的藥物進行治療，發現治療效果在遺傳敏感性模型上被削弱。
研究還在整個轉錄組水平上研究了藥物反應和作用，以評估藥物機制和整體細胞反應（包括不良反應），RNA-seq顯示，在可以同等減少脂肪變性的所有不同藥物的處理下，差異基因表達分析存在明顯差異。實驗結果顯示，對NAFLD有效的藥物通過一個共同的機制起作用，即阻止糖生成脂類。該研究還觀察到，NAFLD高風險突變的類器官（PNPLA3I148M/I148M）與沒有突變的類器官（PNPLA3WT）對所有藥物的應答方式不同，這表明類器官可以作為個性化醫療的工具。
圖3 基于類器官模型的藥物篩選
3. 建立FatTracer平臺
研究人員利用突變體，對潛在的脂肪變性調節劑和可能的藥物靶點進行基于CRISPR的遺傳篩選，并將這個平臺命名為FatTracer。受到藥物篩選中出現的非常特定的靶點依賴性的啟發，對35個與脂質代謝和NAFLD有關的候選基因進行了篩選，發現FADS2基因（編碼脂肪酸去飽和酶2）是一個未見報道的、與NAFLD疾病相關的關鍵基因，FADS2基因的缺失使得類器官中的脂肪含量大大增加，FADS2過表達顯著降低了脂肪沉積的程度。因此，FADS2表達水平的調節直接決定了肝細胞內脂肪變性的水平，無論是發展中的脂肪變性還是已經存在的脂肪變性，表明FADS2是治療NAFLD的一個新的有效治療靶點。
圖4 FatTracer篩選平臺
三、編者點評
這是一項非常先進的類器官研究，并且與深受NAFLD困擾的患者息息相關。本篇文章捕獲了一個新的關鍵性基因FADS2，是治療NAFLD的一個新的有效治療靶點，可能會對這一種困擾世界1/4人口的疾病有突破性的進展。
此外，本文提供了一種類器官技術的運用新思路，即通過基因編輯構建非腫瘤疾病的類器官模型，用于毒理藥理研究、功效評價等，豐富了體外模型的種類，并且可以解決動物模型與人體對應性不佳的問題。
作為斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展科研服務、智慧實驗室建設和精準醫療三大業務。目前，環特類器官平臺正致力于開發基于基因編輯技術的多種非腫瘤疾病的類器官模型，未來將為食品、藥品、化妝品等行業提供更多精準評價與機制研究模型，敬請期待！
參考資料：
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