蛋白核酸互作是指蛋白和DNA或者RNA之間的相互作用。主要的互作類型有蛋白和蛋白、蛋白和DNA、蛋白和RNA、RNA和小RNA之間的互作模式。作為中心法則的三大成員，他們之間的互作關(guān)系以及調(diào)控關(guān)系是后基因組時(shí)代重要的研究領(lǐng)域，在表觀遺傳學(xué)等不同研究方向上也具有重要的研究意義。而在實(shí)際研究過程中所使用到的蛋白核酸互作的實(shí)驗(yàn)技術(shù)不一，本期將從原理、應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和大家重點(diǎn)分享幾個(gè)蛋白核酸互作技術(shù)：CO-IP(蛋白-蛋白)、ChIP-seq/PCR(蛋白- DNA)、CHIRP(RNA-蛋白-DNA)、RIP-seq/PCR(蛋白-RNA)、RNA pulldown-WB/質(zhì)譜(RNA-蛋白)、Luciferase(轉(zhuǎn)錄因子-啟動(dòng)子或3‘UTR- microRNA等)，旨在幫助大家更快的將這些技術(shù)應(yīng)用到科學(xué)研究中。
實(shí)驗(yàn)原理
CO-IP免疫共沉淀，是研究蛋白和蛋白互作的一種技術(shù)，其原理是利用目的蛋白的抗體從樣本中捕獲和富集與其存在相互作用的蛋白或者蛋白復(fù)合體的技術(shù)，是比較經(jīng)典的研究蛋白互作的技術(shù)之一（往期研究蛋白互作的文章）。抗體富集后的樣本可以直接使用WB技術(shù)檢測(cè)待驗(yàn)證的互作蛋白，也可將富集后的樣本進(jìn)行質(zhì)譜（Mass Spectrum）和生信分析，獲得更多未知互作蛋白的信息。
CO-IP流程示意圖
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
該技術(shù)主要應(yīng)用于研究已知蛋白和已知或者未知蛋白互作的探究，是研究蛋白和蛋白互作的超實(shí)用工具之一。
樣本類型：一般是細(xì)胞裂解液，可以是外源過表達(dá)目的蛋白（加標(biāo)簽），也可以使用內(nèi)源蛋白抗體直接做IP。另外細(xì)胞可以是所研究的腫瘤細(xì)胞（內(nèi)源驗(yàn)證），也可以使用HEK293T做外源驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn)分組：空細(xì)胞（可選）、IgG（以排除抗體的非特異性吸附）、目的抗體（富集目的蛋白）。
結(jié)果說明：
CO-IP研究蛋白互作結(jié)果[1]
圖中WT: 1–446 amino acids; deN30: 31–446 amino acids; deN:125–446 amino acids; deC:1–330 amino acids
CO-IP結(jié)果中的Input組一方面是為了衡量上樣量的一致性，一方面可以檢測(cè)細(xì)胞裂解中目的蛋白是否可被檢測(cè)到以及相應(yīng)的條帶大小。IP組的結(jié)果用以說明目的蛋白是否和下游蛋白存在互作。該實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建不同截短的Bcl-3-flag探究和Smad3-HA的互作結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明Bcl-3的N端序列（de N組）的31-125氨基酸區(qū)域是和Smad結(jié)合所必須的。
實(shí)驗(yàn)原理
ChIP實(shí)驗(yàn)流程示意圖[2]
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
樣本類型：細(xì)胞或組織
實(shí)驗(yàn)分組：ChIP實(shí)驗(yàn)的對(duì)照選擇比較關(guān)鍵，是評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性的重要依據(jù)，一般設(shè)有如下分組：
① 實(shí)驗(yàn)內(nèi)對(duì)照：即Input DNA（斷裂后的基因組DNA）作為ChIP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照。內(nèi)對(duì)照該組可驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)體系中染色質(zhì)的斷裂效果；若根據(jù)Input中的DNA靶序列的含量和IP后樣本中的靶序列含量，可間接推算ChIP的實(shí)驗(yàn)效率；
② 陽性抗體對(duì)照：常用組蛋白抗體作為陽性對(duì)照。通常選擇與已知序列相結(jié)合的、各物種之間比較保守的蛋白抗體；
③ 陰性抗體對(duì)照：常用IgG作為陰性對(duì)照組，也可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白。
結(jié)果說明：ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果中最關(guān)鍵的結(jié)果是相對(duì)免疫沉淀的效率（富集效率）和相對(duì)的蛋白與DNA 結(jié)合能力（富集倍數(shù)），該指標(biāo)和靶蛋白在細(xì)胞中的豐度高度相關(guān)，一般來說可以將相對(duì)于IgG對(duì)照組的3-5倍定為實(shí)驗(yàn)質(zhì)控的最低閾值，同時(shí)可根據(jù)已報(bào)導(dǎo)文獻(xiàn)做相應(yīng)的調(diào)整。
ChIP- PCR結(jié)果展示[3]
該實(shí)驗(yàn)通過3個(gè)目的蛋白的抗體進(jìn)行ChIP（anti-TET1, anti-TET2, anti-TET3），然后qPCR鑒定轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子的結(jié)合，結(jié)果表明，TET1/2/3均可以和PTENp1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，其中TET1的結(jié)合更強(qiáng)。
實(shí)驗(yàn)原理
CHIRP是一種檢測(cè)體內(nèi)與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。該技術(shù)是通過設(shè)計(jì)與目標(biāo)RNA序列反向互補(bǔ)的生物素探針，把目標(biāo)RNA拉下來以后（此步驟類似于RNA pulldown），則與其共同作用的DNA染色體片段就會(huì)被間接富集到鏈霉親和素磁珠上，最后通過qRT-PCR或測(cè)序來測(cè)定目的RNA、DNA序列，也可通過Western或質(zhì)譜分析來測(cè)定蛋白所富集的蛋白種類。
CHIRP實(shí)驗(yàn)流程圖
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
該技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)在于既可研究RNA、蛋白質(zhì)和DNA形成的復(fù)合體之間的互作，也可研究它們之間的兩兩互作；利用CHIRP-MS實(shí)驗(yàn)尋找與目的lncRNA結(jié)合的蛋白（CHIRP-Protein），可不受lncRNA長(zhǎng)度的限制；利用CHIRP實(shí)驗(yàn)可研究circRNA與蛋白質(zhì)（CHIRP-Protein）或DNA（CHIRP-DNA）之間的互作。
樣本類型：一般為細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)分組：
IP組：即實(shí)驗(yàn)組，用于鑒定lncRNA/circRNA作用于基因組的位置；
lacZ組：外參對(duì)照組，用于證明ChIRP探針的特異性；
Input組：捕獲前分離提取的基因組DNA作為內(nèi)參對(duì)照組，證明探針特異性；
Positive組：陽性對(duì)照組，通過已知驗(yàn)證有效的探針，通過WB檢測(cè)已知結(jié)合蛋白質(zhì)，證明整個(gè)ChIRP實(shí)驗(yàn)體系的有效性；目標(biāo)lncRNA/circRNA qPCR：證明ChIRP探針對(duì)目標(biāo)lncRNA的正確結(jié)合及有效捕獲。
實(shí)驗(yàn)原理
和ChIP不同的是，RIP是研究蛋白和RNA互作關(guān)系的一種技術(shù)手段。其原理和CO-IP以及ChIP類似，也是基于抗原-抗體的方式，利用目的蛋白抗體富集和沉淀下來蛋白所結(jié)合的RNA的過程。流程如下：裂解細(xì)胞-抗體孵育-免疫沉淀- RNA純化-建庫測(cè)序/qPCR。
RIP實(shí)驗(yàn)流程圖示[4]
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
探究目的蛋白和核酸之間的互作關(guān)系，這里的核酸可以是mRNA，也可以是非編碼RNA，如circRNA，lncRNA，miRNA等。
樣本類型：一般為細(xì)胞裂解液。
實(shí)驗(yàn)分組：和ChIP類似需要相應(yīng)的對(duì)照。
① 實(shí)驗(yàn)內(nèi)對(duì)照：即Input RNA，作為RIP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)對(duì)照。
② 陽性抗體對(duì)照：常用組蛋白抗體作為陽性對(duì)照，比如sn RNP70。
③ 陰性抗體對(duì)照：常用IgG作為陰性對(duì)照組，也可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白
RIP-seq和RIP- PCR結(jié)果展示[5]
結(jié)果說明：該實(shí)驗(yàn)是RIP-seq后通過生信分析，挑選了待驗(yàn)證的基因做了qPCR驗(yàn)證。其中B圖是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的IP質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，左圖是富集后的RNA質(zhì)量檢測(cè)，右圖驗(yàn)證了抗體的有效性；C-D是DNA測(cè)序后的生信分析，分別是motif和對(duì)所富集基因的KEGG分析。E檢測(cè)在有無IR處理?xiàng)l件下，DNA-PKcs和ITGA3、ITGA5 、ITGAV、SDC4、CD44的互作。
實(shí)驗(yàn)原理
RNA pulldown也是研究蛋白和RNA互作關(guān)系的一種技術(shù)手段，與RIP不同的是，此實(shí)驗(yàn)原理是利用體外轉(zhuǎn)錄法合成RNA，同時(shí)標(biāo)記上生物素作為探針，通過與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)富集細(xì)胞裂解液中蛋白的過程，經(jīng)常和RIP一起使用，互相驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。對(duì)于富集后的產(chǎn)物，可以做質(zhì)譜鑒定和RNA結(jié)合的未知蛋白有哪些; 也可以通過Western blot鑒定是否和某已知蛋白存在互作。
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
樣本類型：一般為細(xì)胞裂解液。
實(shí)驗(yàn)分組：目的基因探針組（sense）、陰性探針組（anti-sense）
RNA-pulldown-WB圖示[6]
結(jié)果說明：該實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般會(huì)提供一個(gè)蛋白銀染的數(shù)據(jù)，用以說明目的探針組和陰性探針組富集條帶的差異性，然后選擇富集的條帶做質(zhì)譜分析以獲得潛在的和RNA存在互作的蛋白信息。
實(shí)驗(yàn)原理
將目的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控原件如某轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建到帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達(dá)載體構(gòu)建成報(bào)告基因質(zhì)粒。將報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞如293T，之后裂解細(xì)胞并加入底物熒光素(luciferin)，熒光素酶可催化luciferin發(fā)出熒光(最強(qiáng)波長(zhǎng)在560nm左右)。檢測(cè)得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對(duì)該轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響水平。由于會(huì)轉(zhuǎn)入Renilla luciferase的報(bào)告基因質(zhì)粒作為內(nèi)參(最強(qiáng)波長(zhǎng)在465nm左右)，因此稱為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)。
應(yīng)用場(chǎng)景和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
樣本類型：一般是在293T細(xì)胞中驗(yàn)證。
實(shí)驗(yàn)分組：研究轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子一般分為4組，研究3‘UTR- miRNA的一般有6組。
啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子：
miRNA和靶基因：
這些蛋白-核酸互作在實(shí)際應(yīng)用中，可以通過哪些組合設(shè)計(jì)，高效提升機(jī)制探究的效率呢？通過一篇文獻(xiàn)和大家簡(jiǎn)要說明哪些互作實(shí)驗(yàn)可以聯(lián)動(dòng)，用以解釋哪些重要科學(xué)問題。
meRIP、RIP-seq鑒定目的基因KIAA1429的下游機(jī)制基因GATA3[7]
作者前期在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)了影響肝癌患者生存預(yù)后以及影響肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移（細(xì)胞和動(dòng)物水平）的重要基因KIAA1429。該基因是m6A writers,因此作者首先檢測(cè)敲減KIAA1429后細(xì)胞中m6A修飾的變化，發(fā)現(xiàn)敲減此基因后，RNA的m6A修飾下降（a-b，e），通過和RIP-seq、RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)7個(gè)交集基因，并且通過RIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其中GATA3與KIAA1429作用更強(qiáng)。
KIAA1429通過調(diào)控GATA3 的3 ' UTR m6A修飾而影響其表達(dá)[7]
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MeRIP-seq結(jié)果顯示敲減KIAA1429細(xì)胞中的GATA33 基因3' UTR區(qū)域的m6A高度富集（a-b），并且通過WB看出下調(diào)KIAA1429的CDS-3’UTR后，GATA3表達(dá)上調(diào)，而在敲減CDS區(qū)未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象（c）。RIP-PCR結(jié)果顯示敲減KIAA1429后RNA結(jié)合蛋白HuR上調(diào)。然后通過Luciferase實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此調(diào)控方式。進(jìn)而得出結(jié)論：調(diào)控GATA3表達(dá)的途徑是kiaa1429介導(dǎo)的m6A修飾GATA3 3 ' UTR。
【參考文獻(xiàn)】
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3.Cao, L.Q., et al., Exosomal miR-21 regulates the TETs/PTENp1/PTEN pathway to promote hepatocellular carcinoma growth. Mol Cancer, 2019. 18(1): p. 148.
4.Qi, Y., et al., MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10. Oncotarget, 2016. 7(11): p. 12693-703.
5.Song, Z., et al., Genome-wide identification of DNA-PKcs-associated RNAs by RIP-Seq. Signal Transduct Target Ther, 2019. 4: p. 22.
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