蛋白核酸互作是指蛋白和DNA或者RNA之間的相互作用。主要的互作類型有蛋白和蛋白、蛋白和DNA、蛋白和RNA、RNA和小RNA之間的互作模式。作為中心法則的三大成員，他們之間的互作關系以及調控關系是后基因組時代重要的研究領域，在表觀遺傳學等不同研究方向上也具有重要的研究意義。而在實際研究過程中所使用到的蛋白核酸互作的實驗技術不一，本期將從原理、應用場景和實驗設計和大家重點分享幾個蛋白核酸互作技術：CO-IP(蛋白-蛋白)、ChIP-seq/PCR(蛋白- DNA)、CHIRP(RNA-蛋白-DNA)、RIP-seq/PCR(蛋白-RNA)、RNA pulldown-WB/質譜(RNA-蛋白)、Luciferase(轉錄因子-啟動子或3‘UTR- microRNA等)，旨在幫助大家更快的將這些技術應用到科學研究中。
實驗原理
CO-IP免疫共沉淀，是研究蛋白和蛋白互作的一種技術，其原理是利用目的蛋白的抗體從樣本中捕獲和富集與其存在相互作用的蛋白或者蛋白復合體的技術，是比較經典的研究蛋白互作的技術之一（往期研究蛋白互作的文章）?？贵w富集后的樣本可以直接使用WB技術檢測待驗證的互作蛋白，也可將富集后的樣本進行質譜（Mass Spectrum）和生信分析，獲得更多未知互作蛋白的信息。
CO-IP流程示意圖
應用場景和實驗設計
該技術主要應用于研究已知蛋白和已知或者未知蛋白互作的探究，是研究蛋白和蛋白互作的超實用工具之一。
樣本類型：一般是細胞裂解液，可以是外源過表達目的蛋白（加標簽），也可以使用內源蛋白抗體直接做IP。另外細胞可以是所研究的腫瘤細胞（內源驗證），也可以使用HEK293T做外源驗證。
實驗分組：空細胞（可選）、IgG（以排除抗體的非特異性吸附）、目的抗體（富集目的蛋白）。
結果說明：
CO-IP研究蛋白互作結果[1]
圖中WT: 1–446 amino acids; deN30: 31–446 amino acids; deN:125–446 amino acids; deC:1–330 amino acids
CO-IP結果中的Input組一方面是為了衡量上樣量的一致性，一方面可以檢測細胞裂解中目的蛋白是否可被檢測到以及相應的條帶大小。IP組的結果用以說明目的蛋白是否和下游蛋白存在互作。該實驗通過構建不同截短的Bcl-3-flag探究和Smad3-HA的互作結構域，結果表明Bcl-3的N端序列（de N組）的31-125氨基酸區域是和Smad結合所必須的。
實驗原理
ChIP實驗流程示意圖[2]
應用場景和實驗設計
樣本類型：細胞或組織
實驗分組：ChIP實驗的對照選擇比較關鍵，是評估實驗結果可靠性的重要依據，一般設有如下分組：
① 實驗內對照：即Input DNA（斷裂后的基因組DNA）作為ChIP實驗的內對照。內對照該組可驗證實驗體系中染色質的斷裂效果；若根據Input中的DNA靶序列的含量和IP后樣本中的靶序列含量，可間接推算ChIP的實驗效率；
② 陽性抗體對照：常用組蛋白抗體作為陽性對照。通常選擇與已知序列相結合的、各物種之間比較保守的蛋白抗體；
③ 陰性抗體對照：常用IgG作為陰性對照組，也可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白。
結果說明：ChIP實驗結果中最關鍵的結果是相對免疫沉淀的效率（富集效率）和相對的蛋白與DNA 結合能力（富集倍數），該指標和靶蛋白在細胞中的豐度高度相關，一般來說可以將相對于IgG對照組的3-5倍定為實驗質控的最低閾值，同時可根據已報導文獻做相應的調整。
ChIP- PCR結果展示[3]
該實驗通過3個目的蛋白的抗體進行ChIP（anti-TET1, anti-TET2, anti-TET3），然后qPCR鑒定轉錄因子和啟動子的結合，結果表明，TET1/2/3均可以和PTENp1的啟動子區結合，其中TET1的結合更強。
實驗原理
CHIRP是一種檢測體內與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。該技術是通過設計與目標RNA序列反向互補的生物素探針，把目標RNA拉下來以后（此步驟類似于RNA pulldown），則與其共同作用的DNA染色體片段就會被間接富集到鏈霉親和素磁珠上，最后通過qRT-PCR或測序來測定目的RNA、DNA序列，也可通過Western或質譜分析來測定蛋白所富集的蛋白種類。
CHIRP實驗流程圖
應用場景和實驗設計
該技術最大的優勢在于既可研究RNA、蛋白質和DNA形成的復合體之間的互作，也可研究它們之間的兩兩互作；利用CHIRP-MS實驗尋找與目的lncRNA結合的蛋白（CHIRP-Protein），可不受lncRNA長度的限制；利用CHIRP實驗可研究circRNA與蛋白質（CHIRP-Protein）或DNA（CHIRP-DNA）之間的互作。
樣本類型：一般為細胞。
實驗分組：
IP組：即實驗組，用于鑒定lncRNA/circRNA作用于基因組的位置；
lacZ組：外參對照組，用于證明ChIRP探針的特異性；
Input組：捕獲前分離提取的基因組DNA作為內參對照組，證明探針特異性；
Positive組：陽性對照組，通過已知驗證有效的探針，通過WB檢測已知結合蛋白質，證明整個ChIRP實驗體系的有效性；目標lncRNA/circRNA qPCR：證明ChIRP探針對目標lncRNA的正確結合及有效捕獲。
實驗原理
和ChIP不同的是，RIP是研究蛋白和RNA互作關系的一種技術手段。其原理和CO-IP以及ChIP類似，也是基于抗原-抗體的方式，利用目的蛋白抗體富集和沉淀下來蛋白所結合的RNA的過程。流程如下：裂解細胞-抗體孵育-免疫沉淀- RNA純化-建庫測序/qPCR。
RIP實驗流程圖示[4]
應用場景和實驗設計
探究目的蛋白和核酸之間的互作關系，這里的核酸可以是mRNA，也可以是非編碼RNA，如circRNA，lncRNA，miRNA等。
樣本類型：一般為細胞裂解液。
實驗分組：和ChIP類似需要相應的對照。
① 實驗內對照：即Input RNA，作為RIP實驗的內對照。
② 陽性抗體對照：常用組蛋白抗體作為陽性對照，比如sn RNP70。
③ 陰性抗體對照：常用IgG作為陰性對照組，也可以選擇目的蛋白抗體宿主的血清蛋白
RIP-seq和RIP- PCR結果展示[5]
結果說明：該實驗是RIP-seq后通過生信分析，挑選了待驗證的基因做了qPCR驗證。其中B圖是實驗組和對照組的IP質控數據，左圖是富集后的RNA質量檢測，右圖驗證了抗體的有效性；C-D是DNA測序后的生信分析，分別是motif和對所富集基因的KEGG分析。E檢測在有無IR處理條件下，DNA-PKcs和ITGA3、ITGA5 、ITGAV、SDC4、CD44的互作。
實驗原理
RNA pulldown也是研究蛋白和RNA互作關系的一種技術手段，與RIP不同的是，此實驗原理是利用體外轉錄法合成RNA，同時標記上生物素作為探針，通過與鏈霉親和素標記的磁珠結合從而實現富集細胞裂解液中蛋白的過程，經常和RIP一起使用，互相驗證實驗結果的可靠性。對于富集后的產物，可以做質譜鑒定和RNA結合的未知蛋白有哪些; 也可以通過Western blot鑒定是否和某已知蛋白存在互作。
應用場景和實驗設計
樣本類型：一般為細胞裂解液。
實驗分組：目的基因探針組（sense）、陰性探針組（anti-sense）
RNA-pulldown-WB圖示[6]
結果說明：該實驗結果一般會提供一個蛋白銀染的數據，用以說明目的探針組和陰性探針組富集條帶的差異性，然后選擇富集的條帶做質譜分析以獲得潛在的和RNA存在互作的蛋白信息。
實驗原理
將目的基因轉錄調控原件如某轉錄因子構建到帶有熒光素酶(Firefly luciferase)的表達載體構建成報告基因質粒。將報告基因質粒轉染細胞如293T，之后裂解細胞并加入底物熒光素(luciferin)，熒光素酶可催化luciferin發出熒光(最強波長在560nm左右)。檢測得到的熒光值高低可以判斷不同處理組對該轉錄調控的影響水平。由于會轉入Renilla luciferase的報告基因質粒作為內參(最強波長在465nm左右)，因此稱為雙熒光素酶報告基因系統。
應用場景和實驗設計
樣本類型：一般是在293T細胞中驗證。
實驗分組：研究轉錄因子和啟動子一般分為4組，研究3‘UTR- miRNA的一般有6組。
啟動子和轉錄因子：
miRNA和靶基因：
這些蛋白-核酸互作在實際應用中，可以通過哪些組合設計，高效提升機制探究的效率呢？通過一篇文獻和大家簡要說明哪些互作實驗可以聯動，用以解釋哪些重要科學問題。
meRIP、RIP-seq鑒定目的基因KIAA1429的下游機制基因GATA3[7]
作者前期在臨床樣本中發現了影響肝癌患者生存預后以及影響肝癌細胞增殖、轉移（細胞和動物水平）的重要基因KIAA1429。該基因是m6A writers,因此作者首先檢測敲減KIAA1429后細胞中m6A修飾的變化，發現敲減此基因后，RNA的m6A修飾下降（a-b，e），通過和RIP-seq、RNA-seq測序數據聯合分析，發現7個交集基因，并且通過RIP-seq數據發現，其中GATA3與KIAA1429作用更強。
KIAA1429通過調控GATA3 的3 ' UTR m6A修飾而影響其表達[7]
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MeRIP-seq結果顯示敲減KIAA1429細胞中的GATA33 基因3' UTR區域的m6A高度富集（a-b），并且通過WB看出下調KIAA1429的CDS-3’UTR后，GATA3表達上調，而在敲減CDS區未發現此現象（c）。RIP-PCR結果顯示敲減KIAA1429后RNA結合蛋白HuR上調。然后通過Luciferase實驗驗證此調控方式。進而得出結論：調控GATA3表達的途徑是kiaa1429介導的m6A修飾GATA3 3 ' UTR。
【參考文獻】
1.Chen, X., et al., Bcl-3 regulates TGFbeta signaling by stabilizing Smad3 during breast cancer pulmonary metastasis. Cell Death Dis, 2016. 7(12): p. e2508.
2.Nakato, R. and T. Sakata, Methods for ChIP-seq analysis: A practical workflow and advanced applications. Methods, 2021. 187: p. 44-53.
3.Cao, L.Q., et al., Exosomal miR-21 regulates the TETs/PTENp1/PTEN pathway to promote hepatocellular carcinoma growth. Mol Cancer, 2019. 18(1): p. 148.
4.Qi, Y., et al., MALAT1 long ncRNA promotes gastric cancer metastasis by suppressing PCDH10. Oncotarget, 2016. 7(11): p. 12693-703.
5.Song, Z., et al., Genome-wide identification of DNA-PKcs-associated RNAs by RIP-Seq. Signal Transduct Target Ther, 2019. 4: p. 22.
6. Wang, S., et al., Circular RNA FOXP1 promotes tumor progression and Warburg effect in gallbladder cancer by regulating PKLR expression. Mol Cancer, 2019. 18(1): p. 145.
7. Lan, T., et al., KIAA1429 contributes to liver cancer progression through N6-methyladenosine-dependent post-transcriptional modification of GATA3. Mol Cancer, 2019. 18(1): p. 186.