構建基因文庫是整個高通量測序（NGS）過程中尤為關鍵的一步，基因文庫的質量將直接影響后續測序工作。接頭（Adapter）是NGS文庫構建環節不可或缺的關鍵部分，其中包含的 Index 序列用于區分不同樣本，使得單次測序或單個 Flow Cell 通道中允許多個樣本混合測序。隨著測序通量和測序需求的增加，接頭種類上從單端Index、雙端組合型index接頭到UDI接頭，甚至達到上千種index 種類，包裝形式上也從傳統的管式接頭到適配自動化建庫的板式包裝接頭延伸。與此同時，兼容市面上主流的Illumina&MGI平臺的通用接頭也層出不窮，完美解決不同應用場景下的NGS接頭需求。

接頭的常見類型

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根據樣本身份證Index位置可以將接頭分為單端Index接頭和雙端Index接頭

單端Index接頭：指的是僅在P5端或P7端存在Index（一般在P7端）；

雙端Index接頭：指的在P5和P7端均存在Index。比單端Index能容納更多數目的樣本，被廣泛使用。

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根據接頭是否匹配PCR-free建庫可以將接頭分為長接頭和短接頭

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長接頭又稱為完整接頭：以Illumina平臺接頭為例，包括P5/P7+Index序列+Read 1/2，完整接頭通過TA克隆的方式連接到DNA片段之后，可以直接上機測序（但是當DNA量不夠時還需進行PCR擴增使得產物達到一定的量方可上機測序）；

短接頭又叫不完整接頭：通過TA克隆方式連接到DNA片段上后，必須與短接頭互補的引物進行PCR擴增，有完整的文庫結構后才能上機測序。

Index作為接頭中的重要組成部分，簡單來說Index是混合樣本中不同樣本的“身份證”，其本身就是一段堿基序列，一般長6nt或8nt。通過對這種“身份證”的識別，就可以在混合樣本中對單個樣本的數據進行識別。Index的選擇通常需滿足兩個原則：堿基平衡和熒光信號平衡。

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堿基平衡，指的是Index的復雜度和平衡度，是多個Index之間的平衡。組合的原則是：同一組index中的A/T/C/G四種堿基都需要包含，且這4種堿基的比例接近，各占25%左右。

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熒光信號平衡，是指在不能保證堿基平衡的情況下，選擇保證熒光信號的平衡。在Illumina平臺中的4通道測序儀中，dG/dT使用綠色熒光標記，dC/dA使用紅色熒光標記。測序時每個循環里綠色和紅色兩種熒光信號都必須存在以保證測序順利進行。因此在選擇Index時需要考慮綠色信號和紅色信號的平衡。

圖3. 符合堿基平衡的Index號（ATGC,TACG,GCTA,CGAT）舉例，分別符合單個Index內部平衡和多個Index相應堿基位的堿基平衡（左）；不符合堿基平衡但符合激光平衡的Index號（ATGC,TACG,AGAG,TCTC）舉例（右）。

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雙端index之CDI接頭：Combined Dual Index，一對多的接頭，即可以根據一定的要求對兩端的index進行組合，最終形成的是雙端index文庫

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雙端index之UDI&UDB接頭：減少index hopping和mis-assignment

兩端index成組設計，雙端唯一，兩端可交叉驗證。采用雙端唯一index分析數據時，可以將index錯誤分配率降低到0.01%，與之前常規的index排列組合方法對比，index hopping降低了兩個數量級。使用UDI接頭可以大幅度降低illumina測序過程中因為機器測序或者實驗過程中引入的交叉污染，從而盡可能避免測序數據“張冠李戴”的現象。但其實并非UDI接頭可以防止交叉，而是發生序列交叉了之后，可以丟棄這部分數據。

圖4.UDI接頭index排列組合效果圖

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UMI接頭：低頻突變檢測、絕對定量的利器

UMI接頭包含P5 Index、P7 Index和UMI元件，其中，UMI分子標簽可以設計為完全隨機的核苷酸鏈、部分簡并核苷酸鏈或者固定核苷酸鏈。根據UMI標簽所在的位置，又可以將UMI接頭分為單端UMI（10 nt）接頭（UMI標簽緊隨P7端Index）和雙端UMI（5-8 nt）接頭（UMI標簽位于插入片段兩端）。

在UDI接頭結構的基礎上引入UMI標簽，通過對原始DNA分子片段進行標記，能夠驗證測序結果在原始DNA序列上的一致性，分辨出檢測到的突變是真實的低頻突變還是來源于測序錯誤和PCR擴增錯誤，從而過濾掉背景噪音，實現低頻突變的準確檢測。

圖5.UMI接頭相關結構和產品信息

板式包裝接頭

采用自動化設備來進行高通量NGS樣本建庫，傳統的管式包裝接頭已經無法滿足需求。為了更好的匹配當前的自動化設備，針對Illumina和MGI平臺分別開發了由96微孔板包裝的384 UDI接頭試劑盒。其中，Illumina平臺為完整型長接頭，MGI平臺為截短型接頭。板式包裝接頭搭配自動化建庫試劑盒，可以完美解決當前的手動建庫試劑盒與自動化平臺的兼容性問題！

圖6.板式包裝接頭試劑盒和穩定性數據

接頭產品選擇指南