作者：DJ孟
circRNA是一類閉合環狀的非編碼RNA分子，起初被認定為是轉錄副產物，但后來隨著高通量測序和實驗技術的不斷發展，人們發現了很多具有功能的circRNA。研究表明circRNA在生物的生長發育、疾病的發生和發展過程中發揮著重要作用，其在疾病診斷標記物方面有很大的應用前景。
本文圍繞circRNA的形成與鑒定、功能機制和circRNA的上下調方式等展開闡述，希望能為初進circRNA研究領域的新手小白提供幫助！
一、circRNA的形成
根據circRNA的組成結構不同，將其分為內含子ciRNA、外顯子ecircRNA和內含子-外顯子ElciRNA三類。不同類型circRNA的成環機制也有所不同，主要有4種：
（1）環化外顯子5’和3’剪接處通過不斷組裝小核核糖體蛋白，形成套索結構，引起外顯子跳讀，驅動環化；
（2）環化外顯子的兩側翼內含子通過堿基互補配對，形成并排雙鏈從而驅動環化；
（3）RNA結合蛋白（RBP）通過結合側翼內含子序列，促進外顯子的環化；
（4）內含子依靠5‘和3’端的motif序列反向拼接驅動環化，后經剪切形成成熟的circRNA。
知道circRNA的組成和環化機制后，我們可以挑選表達差異較顯著的circRNA進行序列分析，并做下一步的環狀結構驗證。
circRNA的形成機制圖9
二、circRNA的鑒定
針對circRNA環狀結構的鑒定，第一步就是先針對環化序列兩側設計反向引物，sanger測序得到拼接位點序列。因為circRNA是閉合環形，比線性RNA結構穩定，可以利用R NaseR外切酶消化總RNA，檢測消化前后circRNA的表達,富集到大量的circRNA。
另外，利用特異性探針進行Northern blot檢測和轉錄抑制劑放線菌素D檢測半衰期，進一步證明circRNA的環狀結構。
最后，要想研究circRNA的功能機制，首先要知道circRNA在細胞中的定位，不同定位的circRNA對應的功能機制也不同，可以通過核質分離和FISH檢測circRNA的細胞定位1。
三、circRNA的作用機制
對于定位在細胞核內的circRNA主要有2種作用機制：
a. circRNA可以與環化位點處的宿主基因結合，通過形成 RNA-DNA 雜合體（R 環結構）使基因轉錄暫?；蚪K止，導致表達轉錄本被截短2；
b. EIciRNA通過與 U1 snRNP 、Pol II 相互作用于親本基因啟動子區，從而增強基因的轉錄過程3。（詳細參考:核內circRNA的機制研究如何開展？）
circRNA的作用機制圖9
而定位于細胞質內表達的circRNA作用機制大致有4類：
c. ceRNA機制，算是比較經典并且做得最多的研究思路。CircRNA通過充當miRNA的分子海綿，上調miRNA靶標mRNA的表達。比如CDR1as包含63個保守的miR-7結合位點，它通過間接調控miR-7靶標mRNA的表達，影響斑馬魚中腦的發育4和腫瘤疾病等進程5。
d. circRNA通過與蛋白互作，進一步促使蛋白之間結合或分離，可能也會導致結合蛋白在細胞核或細胞質中滯留。另外，circRNA能夠促進RBPs與mRNAs的結合，從而通過穩定mRNAs促進翻譯過程，如circPOK與白介素增強子結合因子2/3(ILF2/3) 復合物作用，穩定了IL-6和VEGF，間接調控腫瘤的發生過程6。
最后2種功能機制與circRNA的翻譯潛能有關。
比如e. 具有ORF和IRES元件的circRNA可以直接招募核糖體啟動翻譯。
f. 對于那些沒有IRES，但是含有M6A位點的circRNA通過識別并結合YTHDF3，招募eIF4G2，從而起始翻譯7。（關于circRNA編碼的預測和驗證，詳細可參考:突破認知：LncRNA、circRNA編碼啦?。。?/a>
四、circRNA的上下調
如果要研究某個感興趣的circRNA作用機制時，那研究過程中一定少不了對circRNA進行敲低/敲除和過表達。
對于敲低circRNA來說，首先要針對circRNA環化拼接位點處設計特異性敲低靶點，這樣可以防止對親本基因的敲低。另外，由于RNA誘導沉默復合體存在細胞質中，所以，一般siRNA對細胞核內的circRNA敲低效率較低，這時可采用化學合成的ASO敲低基因的表達3。
如果要敲除掉circRNA的話，由于circRNA側翼內含子中的短散在元件SINE（Alu）序列有助于外顯子環化，所以可以利用CRISPR/Cas9技術將側翼內含子的Alu序列敲除，通過阻止反向剪接過程達到circRNA敲除的目的，同時也能避免對親本基因的表達產生影響8。但是，這可能存在ALU選擇困難或者影響其他circRNA形成的問題。對于內含子circRNA，可以將整個內含子敲除掉。但是由于CRISPR/Cas9敲除操作復雜，動物水平敲除效率較低，所以一般建議先做siRNA敲低，如果敲低無效再選擇敲除的方式。
針對circRNA的過表達，主要有2種構建方法：
a. 由于circRNA本身就能環化，所以將circRNA兩側的內含子序列充當環化臂進行構建；
b. 另外，也可以取一側內含子序列1kb，另一 側構建互補序列充當環化臂，最后檢測circRNA的過表達效率，取最佳構建方式3。
不過，現在不用那么麻煩去檢測哪種方式效率最高，直接把circRNA線性序列插入到商業化的circRNA過表達載體（帶有環化臂）中，即可驅動環化實現過表達。
實際上，circRNA的功能最終涉及與其他分子的相互作用，雖然我們知道了很多機制，但是仍然存在很多問題沒有答案。比如：有沒有與circRNA結合的ncRNA或其他分子？是什么決定了circRNA成為蛋白的支架？應該怎樣分析位于其他細胞器中的circRNA呢？或者怎樣能將circRNA遞送到特定的亞細胞區？怎樣才能觀測到體內實時circRNA-蛋白質相互作用的過程呢？等等這些都需要我們不斷地探索。
在探索過程中，吉凱基因可以為廣大老師們提供ceRNA機制熒光素酶構建、circRNA編碼驗證、circRNA過表達載體構建、circRNA敲低/敲除等方案設計。另外，吉凱擁有質粒、慢病毒、腺病毒和AAV多種工具載體，滿足老師們的大部分實驗需求，助力老師們在circRNA領域的實驗研究。
公眾號底部菜單欄【新功能】上線！
免費在線學習《國自然熱點研究》、《數據庫及軟件操作教程》
一鍵下載《病毒使用手冊》、《高分文獻》
還有不定時的送新書、抽獎活動，趕緊來關注一波吧
參考文獻…
1.Ri Chen, et al. N6-methyladenosine modification of circNSUN2 facilitates cytoplasmic export and stabilizes HMGA2 to promote colorectal liver metastasis. Nature Communications. 2019, 10(16): 4695
2. X Xu, et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 2020, 19(1): 128
3. Z Li, et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus[J]. Nature structural & molecular biology. 2015, 22(3): 256-264
4. Zhong Q, Huang J, Wei J, Wu R. Circular RNA CDR1as sponges miR-7-5p to enhance E2F3 stability and promote the growth of nasopharyngeal carcinoma. Cancer Cell Int. 2019, 19: 252
5. Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, Torti F, Krueger J, Rybak A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 2013, 495(7441): 333–8
6. Guarnerio J, Zhang Y, Cheloni G, Panella R, Mae KJ, Simpson M, et al. Intragenic antagonistic roles of protein and circRNA in tumorigenesis. Cell Res. 2019, 29(8): 628–40
7. Y Yang, et al. Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine. Cell Research, 2017, 27: 626-641
8. Q Zheng, et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nat Commun. 2016: 11215
9. W Zhou, Z Cai, J Liu, D Wang, H Ju and R Xu. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Molecular Cancer, 2020, 12: 172