作者：DJ孟
circRNA是一類閉合環(huán)狀的非編碼RNA分子，起初被認定為是轉(zhuǎn)錄副產(chǎn)物，但后來隨著高通量測序和實驗技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)了很多具有功能的circRNA。研究表明circRNA在生物的生長發(fā)育、疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其在疾病診斷標記物方面有很大的應用前景。
本文圍繞circRNA的形成與鑒定、功能機制和circRNA的上下調(diào)方式等展開闡述，希望能為初進circRNA研究領(lǐng)域的新手小白提供幫助！
一、circRNA的形成
根據(jù)circRNA的組成結(jié)構(gòu)不同，將其分為內(nèi)含子ciRNA、外顯子ecircRNA和內(nèi)含子-外顯子ElciRNA三類。不同類型circRNA的成環(huán)機制也有所不同，主要有4種：
（1）環(huán)化外顯子5’和3’剪接處通過不斷組裝小核核糖體蛋白，形成套索結(jié)構(gòu)，引起外顯子跳讀，驅(qū)動環(huán)化；
（2）環(huán)化外顯子的兩側(cè)翼內(nèi)含子通過堿基互補配對，形成并排雙鏈從而驅(qū)動環(huán)化；
（3）RNA結(jié)合蛋白（RBP）通過結(jié)合側(cè)翼內(nèi)含子序列，促進外顯子的環(huán)化；
（4）內(nèi)含子依靠5‘和3’端的motif序列反向拼接驅(qū)動環(huán)化，后經(jīng)剪切形成成熟的circRNA。
知道circRNA的組成和環(huán)化機制后，我們可以挑選表達差異較顯著的circRNA進行序列分析，并做下一步的環(huán)狀結(jié)構(gòu)驗證。
circRNA的形成機制圖9
二、circRNA的鑒定
針對circRNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)的鑒定，第一步就是先針對環(huán)化序列兩側(cè)設(shè)計反向引物，sanger測序得到拼接位點序列。因為circRNA是閉合環(huán)形，比線性RNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可以利用R NaseR外切酶消化總RNA，檢測消化前后circRNA的表達,富集到大量的circRNA。
另外，利用特異性探針進行Northern blot檢測和轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D檢測半衰期，進一步證明circRNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
最后，要想研究circRNA的功能機制，首先要知道circRNA在細胞中的定位，不同定位的circRNA對應的功能機制也不同，可以通過核質(zhì)分離和FISH檢測circRNA的細胞定位1。
三、circRNA的作用機制
對于定位在細胞核內(nèi)的circRNA主要有2種作用機制：
a. circRNA可以與環(huán)化位點處的宿主基因結(jié)合，通過形成 RNA-DNA 雜合體（R 環(huán)結(jié)構(gòu)）使基因轉(zhuǎn)錄暫停或終止，導致表達轉(zhuǎn)錄本被截短2；
b. EIciRNA通過與 U1 snRNP 、Pol II 相互作用于親本基因啟動子區(qū)，從而增強基因的轉(zhuǎn)錄過程3。（詳細參考:核內(nèi)circRNA的機制研究如何開展？）
circRNA的作用機制圖9
而定位于細胞質(zhì)內(nèi)表達的circRNA作用機制大致有4類：
c. ceRNA機制，算是比較經(jīng)典并且做得最多的研究思路。CircRNA通過充當miRNA的分子海綿，上調(diào)miRNA靶標mRNA的表達。比如CDR1as包含63個保守的miR-7結(jié)合位點，它通過間接調(diào)控miR-7靶標mRNA的表達，影響斑馬魚中腦的發(fā)育4和腫瘤疾病等進程5。
d. circRNA通過與蛋白互作，進一步促使蛋白之間結(jié)合或分離，可能也會導致結(jié)合蛋白在細胞核或細胞質(zhì)中滯留。另外，circRNA能夠促進RBPs與mRNAs的結(jié)合，從而通過穩(wěn)定mRNAs促進翻譯過程，如circPOK與白介素增強子結(jié)合因子2/3(ILF2/3) 復合物作用，穩(wěn)定了IL-6和VEGF，間接調(diào)控腫瘤的發(fā)生過程6。
最后2種功能機制與circRNA的翻譯潛能有關(guān)。
比如e. 具有ORF和IRES元件的circRNA可以直接招募核糖體啟動翻譯。
f. 對于那些沒有IRES，但是含有M6A位點的circRNA通過識別并結(jié)合YTHDF3，招募eIF4G2，從而起始翻譯7。（關(guān)于circRNA編碼的預測和驗證，詳細可參考:突破認知：LncRNA、circRNA編碼啦！！）
四、circRNA的上下調(diào)
如果要研究某個感興趣的circRNA作用機制時，那研究過程中一定少不了對circRNA進行敲低/敲除和過表達。
對于敲低circRNA來說，首先要針對circRNA環(huán)化拼接位點處設(shè)計特異性敲低靶點，這樣可以防止對親本基因的敲低。另外，由于RNA誘導沉默復合體存在細胞質(zhì)中，所以，一般siRNA對細胞核內(nèi)的circRNA敲低效率較低，這時可采用化學合成的ASO敲低基因的表達3。
如果要敲除掉circRNA的話，由于circRNA側(cè)翼內(nèi)含子中的短散在元件SINE（Alu）序列有助于外顯子環(huán)化，所以可以利用CRISPR/Cas9技術(shù)將側(cè)翼內(nèi)含子的Alu序列敲除，通過阻止反向剪接過程達到circRNA敲除的目的，同時也能避免對親本基因的表達產(chǎn)生影響8。但是，這可能存在ALU選擇困難或者影響其他circRNA形成的問題。對于內(nèi)含子circRNA，可以將整個內(nèi)含子敲除掉。但是由于CRISPR/Cas9敲除操作復雜，動物水平敲除效率較低，所以一般建議先做siRNA敲低，如果敲低無效再選擇敲除的方式。
針對circRNA的過表達，主要有2種構(gòu)建方法：
a. 由于circRNA本身就能環(huán)化，所以將circRNA兩側(cè)的內(nèi)含子序列充當環(huán)化臂進行構(gòu)建；
b. 另外，也可以取一側(cè)內(nèi)含子序列1kb，另一 側(cè)構(gòu)建互補序列充當環(huán)化臂，最后檢測circRNA的過表達效率，取最佳構(gòu)建方式3。
不過，現(xiàn)在不用那么麻煩去檢測哪種方式效率最高，直接把circRNA線性序列插入到商業(yè)化的circRNA過表達載體（帶有環(huán)化臂）中，即可驅(qū)動環(huán)化實現(xiàn)過表達。
實際上，circRNA的功能最終涉及與其他分子的相互作用，雖然我們知道了很多機制，但是仍然存在很多問題沒有答案。比如：有沒有與circRNA結(jié)合的ncRNA或其他分子？是什么決定了circRNA成為蛋白的支架？應該怎樣分析位于其他細胞器中的circRNA呢？或者怎樣能將circRNA遞送到特定的亞細胞區(qū)？怎樣才能觀測到體內(nèi)實時circRNA-蛋白質(zhì)相互作用的過程呢？等等這些都需要我們不斷地探索。
在探索過程中，吉凱基因可以為廣大老師們提供ceRNA機制熒光素酶構(gòu)建、circRNA編碼驗證、circRNA過表達載體構(gòu)建、circRNA敲低/敲除等方案設(shè)計。另外，吉凱擁有質(zhì)粒、慢病毒、腺病毒和AAV多種工具載體，滿足老師們的大部分實驗需求，助力老師們在circRNA領(lǐng)域的實驗研究。
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