果實成熟是一個有序而復雜的過程，了解果實成熟機制，不僅可以了解如何保持果實品質，而且可以指導延長貯藏期的方式，已有研究表明多種翻譯后修飾和動態轉錄重編程均參與果實成熟調控，但翻譯后修飾和轉錄調控在果實成熟過程中的相互關系尚不清楚。 2021年11月，華南農業大學陸旺金教授和陳建業教授課題組在植物學Top期刊Plant Physiology（IF 8.34）發表了題為“Phosphorylation of transcription factor bZIP21 by MAP kinase MPK6-3 enhances banana fruit ripening”的研究論文。文章利用磷酸化蛋白質組學發現了轉錄因子MabZIP21在果實成熟過程中的重要作用，揭示了MabZIP21影響香蕉果實成熟的具體分子機制。中科新生命提供了磷酸化修飾蛋白組學技術支持服務。 研究材料 未成熟香蕉、成熟香蕉（自然成熟、乙烯催熟、1-MCP延緩成熟）
技術路線
步驟1：磷酸化修飾蛋白組學結果分析；
步驟2：MabZIP21下游靶向基因篩選；
步驟3：MabZIP21相互作用蛋白的確定及功能驗證；
步驟4：MabZIP21主要磷酸化修飾位點的確定及其功能驗證；
步驟5：MabZIP21的反饋調節。
研究結果
1. 磷酸化蛋白質組學分析揭示MabZIP21磷酸化參與香蕉果實的成熟
作者使用未成熟和成熟的香蕉（乙烯誘導成熟）組織樣本進行磷酸化蛋白組學分析，共鑒定到63條在果實成熟過程中差異化表達的磷酸化肽段（對應49個蛋白）（圖1），其中轉錄因子MabZIP21 (Ma04_p35070)的磷酸化水平變化最大。實驗證實，MabZIP21在自然成熟、乙烯催熟和1-MCP延緩成熟三種果肉中的轉錄本水平均顯著增加，并在成熟階段達到最高水平（圖2A）,其磷酸化水平在成熟果實中遠高于未成熟果實（圖2D和2E）。
圖1 成熟果實中的磷酸化蛋白組學分析
圖2 成熟果實中MabZIP21轉錄本和磷酸化水平的變化
2. MabZIP21參與調控多種成熟相關基因
為了深入了解MabZIP21控制香蕉成熟的機制，作者利用DAP-Seq等技術尋找MabZIP21的下游結合基因（圖3），結果發現MabZIP21可直接結合多種成熟相關的基因（比如MaACO1,MaPG3,MaPL5,MaPL15,MaPE42,MaPE51,MaEXPA15）并激活它們的轉錄，證明了MabZIP21參與香蕉的成熟過程（圖4）。
圖3 MabZIP21靶向基因的篩選
圖4 MabZIP21與香蕉成熟相關基因的啟動子直接結合
3. MabZIP21相互作用蛋白的確定及其功能驗證
磷酸化組學結果發現MabZIP21的磷酸化水平發生了明顯的改變且MAPK激酶（相較于其他激酶）更多的參與了成熟香蕉組織中磷酸化水平的變化（圖1D），后續驗證實驗發現MaMPK6-3（MAPK激酶的一種）可直接與MabZIP21結合（圖5A、5B和5D），并增強了MabZIP21的轉錄激活能力（5E）。另外研究還發現MabZIP21在基因調控中可以形成同源二聚體（圖5B和5D）。
將MaMPK6-3瞬轉至香蕉中，結果發現MaMPK6-3過表達的香蕉成熟的更快（圖6B和6C），且磷酸化蛋白的含量更高（圖6D和6E），證明了MaMPK6-3在香蕉成熟和蛋白質磷酸化過程中發揮了重要作用。
圖5 MabZIP21與自身及MaMPK6-3相結合
圖6 MaMPK6-3的過表達促進香蕉成熟、提高磷酸化蛋白含量
4. MabZIP21被MaMPK6-3磷酸化的主要位點確定及其功能驗證
為確定MabZIP21的磷酸化修飾位點，作者采用Phos-tag SDS-PAGE結合LC-MS/MS的方式進行分析，結果表明Ser436和Thr318是MabZIP21上的磷酸化位點（圖7A和7B）。點突變實驗證實Ser436和Thr318的突變會影響MaMPK6-3對MabZIP21的磷酸化修飾（圖7C和7D）、MabZIP21與MaMPK6-3的結合（圖7E和7F）、MabZIP21的轉錄激活活性（圖8A）、MabZIP21與下游成熟相關基因的結合能力（圖8B-8D），以及影響果實的成熟速度（圖9C-9E）和MabZIP21下游成熟相關基因的表達水平（圖9F）。
圖7 MabZIP21磷酸化位點的鑒定
圖8 Ser436和Thr318磷酸化對MabZIP21活性的影響
圖9 Ser436和Thr318磷酸化對香蕉果實成熟的影響
5. MabZIP21激活MaMPK6-3及其自身的轉錄
轉錄因子通常通過形成反饋調節來調控自身的轉錄。本研究證實MabZIP21可與MabZIP21和MaMPK6-3的啟動子結合并正向調控他們的表達(圖10)。
圖10 MabZIP21調控MaMPK6-3及其自身的轉錄
小結
磷酸化蛋白組學技術助力揭示磷酸化修飾的MabZIP21在采后香蕉果實成熟衰老過程中的新機制，該研究成果為改善果蔬貯運品質和制定合理的保鮮物流措施提供了理論支撐。
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