2023年11月16日，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics共同宣布基因編輯療法產品CASGEVY™（Exagaglogene autotemcel）獲英國藥品監管機構MHRA有條件批準上市，用于治療治療鐮狀細胞病（SCD）和輸血依賴性β-地中海貧血（TDT），是全球首款獲批上市的CRISPR基因編輯藥物。

CASGEVY™療法是基于CRISPR/Cas9系統的治療方案，CRISPR/Cas9系統因為其簡單性和易于RNA編程的潛力，是所有CRISPR-Cas系統中用于基因工程開發的最佳候選系統。目前基于CRISPR/Cas9系統的基因編輯技術已經成功應用于治療、育種、合成生物學等各個領域。

CRISPR基因編輯技術，除了眾所周知的CRISPR/Cas9體系外，CRISPR/Cas12a體系正憑借其獨特的優勢逐漸嶄露頭角。與CRISPR/Cas9體系相比，CRISPR/Cas12a體系在核酸酶結構域、向導RNA（gRNA）以及產生的DNA末端類型等方面都有著顯著的差異，詳見下表：

除以上差異外，Cas12a在切割活性方面也與Cas9存在顯著區別。Cas9僅具有順式切割活性，用于DNA雙鏈斷裂。而Cas12a不僅具有順式切割活性，還具備獨特的反式切割活性，這使得它在基因編輯領域展現出更為廣泛的應用潛力。

CRISPR/Cas12a切割活性

  01 

順式切割活性

Cas12a由單個crRNA引導，當形成crRNA-Cas12a復合物時，它的構象會發生變化。然后，該復合物識別DNA非靶標鏈中特定的PAM位點。在距離PAM位點8個核苷酸（nt）的位置，RuVC結構域切割DNA靶標鏈，產生5’端的粘性突出末端。

02 

反式切割活性

Cas12a能夠特異性地識別并切割雙鏈DNA（dsDNA），隨后釋放單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）活性。這種活性使得Cas12a能夠無差別地裂解附近的單鏈DNA（ssDNA）。因此，Cas12a系統可以與LAMP等核酸檢測技術相結合，為核酸檢測、病原體識別等領域提供高效、靈敏且便捷的工具，展現出巨大的應用前景。

基于CRISPR/Cas12a廣泛的應用場景，翌圣鎂孚泰生物ZymeEditor（點擊了解更多）酶改造及發酵純化工藝平臺新開發了來源于細菌Agathobacter rectalis的ArCas12a，與其它Cas12a（LbCas12a/AsCas12a）相比，其具有更高的溫度適應性（25-55℃），非常適用于基因組編輯及核酸檢測等應用場景。

ArCas12a性能展示

 01

dsDNA高效體外切割

以dsDNA模板為靶標，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區）進行體外切割，瓊脂糖凝膠電泳檢測切割效果。結果顯示翌圣的ArCas12a在crRNA的引導下可高效的切割dsDNA（600 bp）產生兩段切割產物（200 bp+400 bp）。

02

反式切割活性強，可用于核酸檢測

以dsDNA模板為靶標，加入ArCas12a、crRNA（存在與模板DNA序列互補的spacer區）及單鏈DNA報告探針（含有熒光報告集團）進行體外切割，當ArCas12a與crRNA及靶標DNA形成復合體后會激活反式切割活性，切割單鏈DNA報告探針，從而發出熒光。結果顯示，翌圣ArCas12a與crRNA及模板DNA形成復合體后具有反式切割活性，可剪切單鏈DNA。

03

無核酸外切酶殘留

將底物DNA與10 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示翌圣的ArCas12a無核酸外切酶殘留。

04

無RNase殘留

將底物RNA與5 pmol ArCas12a共同孵育，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示翌圣的ArCas12a無RNase殘留。

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