上一期我們選了一篇農業領域的客戶文獻來給大家實例講解了一下，回顧請戳：【修飾專欄】MCP-磷酸化修飾與非靶代謝在大豆鹽脅迫中的應用
本期，我們從農業領域轉向醫學領域。我們選擇了一篇非常典型的文獻，來具體解析如何利用磷酸化修飾組定量分析，來研究疾病的機制，以及找到新的治療靶點。
肉瘤（sarcomas）是一種罕見的多樣性惡性腫瘤，多發于骨頭和結締組織。盡管針對肉瘤有手術、放療、化療等多種治療方法，但晚期肉瘤患者存活率低的情況長期沒有得到改善。亟需新的、靶向的系統治療方案。
June 20, 2017; DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-16-2550
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惡性肉瘤磷酸化蛋白組表達譜揭示ALK和MET或可作為滑膜肉瘤亞型的新型治療靶點
Phosphoproteomic Profiling Reveals ALK and MET as Novel Actionable Targets across Synovial Sarcoma Subtypes
Cancer Res：IF=9
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? 研究材料：20種惡性肉瘤細胞株
? 技術方法：磷酸化修飾定量蛋白質組
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技術路線
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研究結果
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1. 樣本選擇：
經過嚴格篩選，作者選定了20株肉瘤細胞株，并展示相關信息：
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2. 磷酸化修飾組分析：
對上述細胞株，進行磷酸化修飾組分析。磷酸化修飾組最終一共鑒定到來源于654個蛋白的1090個酪氨酸磷酸化肽段/位點。
進一步利用這些磷酸化修飾肽段的表達量進行層次聚類分析，從下圖可以看到：這些磷酸化肽段表達可明顯區分為兩種模式——成年人和小兒，而小兒肉瘤細胞株又區分為兩個子集（可以看到磷酸化修飾的模式與疾病分類非常一致）。后續可利用生物信息學進一步挖掘其中的重要信息：
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同時，將磷酸化修飾組結果中，最為關注的激酶數據專門挑出來，進行進一步整理和統計，可以看到不同的激酶種類、數量和樣本中的表達情況：
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3. 挑選出關鍵蛋白，進行表達驗證和初步研究
有了這么豐富的組學數據，就可以對不同細胞系的修飾組定量結果進行比較，將其中具有顯著修飾表達差異的蛋白跳出來，后續即可圍繞其進行深入研究，作者從中組學結果中挑選的是蛋白激酶——ALK。
首先進行初步的驗證和研究：
（1）驗證ALK的修飾量是否的確發生改變：WB實驗
（2）初步闡述ALK發生修飾變化的機制：下圖可見ALK基因發生了截短和重新拼接，從而使得其功能異常
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4. 對挑選出的關鍵蛋白，進行進一步功能驗證
（1）體外水平驗證功能：確認ALK抑制能夠抑制腫瘤細胞生長+WB檢測ALK相關信號通路表達情況：
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（2）在體水平驗證功能：ALK/MET抑制劑藥物，能夠抑制腫瘤載荷動物的腫瘤生長
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5. 對挑選出的關鍵蛋白，進行臨床相關研究
對43例來自于病人的腫瘤組織，進行分析：免疫組化分析發現14%的腫瘤組織具有ALK高表達+FISH分析確認ALK具有截短形式。
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6. 擴展研究
磷酸化蛋白質組在揭示ALK異常的同時，也發現了很多其他蛋白的異常修飾變化，由此提示肉瘤可能存在多通路協同作用的機制。因此，作者采用相同的路線，進行了擴展研究：（1）研究了修飾組結果中的另外一個分子PDGFRα的異常修飾變化，以及進行了相關功能的確證，證實PDGFRα也是一個有效的治療靶點；（2）發現本文研究的兩個靶點——AKL/MET與PDGFRα的聯合干預，能夠取得更好的治療效果。
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老司機心得（必看）
該研究是利用蛋白質翻譯后修飾，揭示新的疾病機制，尋找治療靶點的代表性文章，主要思路： “樣本選擇 → 磷酸化修飾組定量分析 → 篩選感興趣的蛋白，并驗證表達變化 → 功能驗證（細胞＆動物） → 臨床相關分析（表達水平與臨床指標相關性分析），以及進一步進行了藥物聯用的探索。通過磷酸化修飾組的高通量分析篩選修飾水平發生變化的蛋白和位點，進而順藤摸瓜找到關鍵調控機制，并確認干預治療的效果。在醫學基礎研究中非常值得借鑒和參考！
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老司機帶你走的更遠
（1） 該文章的設計，可以說是很完整了，發表的雜志也算是專業領域內的當紅辣子雞。以該設計套路為參照，可以進一步設計成簡配版和高配版。簡單來說，簡配版對應短平快地灌水低分雜志，高配版則用于沖大文章。具體怎么簡配、怎么高配，后續我們會有一期專門總結套路，其中會跟大家詳細解析，敬請期待。感興趣的老師，可以先了解下下述的典型文獻：
?簡配版：Quantitative cardiac phosphoproteomics profiling during ischemia-reperfusion in an immature swine model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2017 Jul 1;313(1):H125-H137.（IF=3.3）
?高配版：Quantitative phosphoproteomics reveal mTORC1 activates de novo pyrimidine synthesis. Science. 2013 Mar 15;339(6125):1320-3. （IF=37.2）
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（2） 上述的分析模式，不僅適用于磷酸化修飾研究，也適用于從其他翻譯后修飾（如乙酰化、泛素化、甲基化，等等）的角度來研究生理過程、疾病或藥物機制。基本的設計套路和模式是相似的，后續我們也會有其他種類修飾的專門內容中為大家做詳細介紹，敬請期待。（廣告時間：除了磷酸化，中科新生命還可提泛素化、酰化、甲基化、N糖基化等各種修飾組學分析服務）。同樣先給大家推薦一些文獻：
?乙酰化：SIRT3 mediates multi-tissue coupling for metabolic fuel switching. Cell Metab. 2015 Apr 7;21(4):637-46. （IF=18.1）
?泛素化：Landscape of the PARKIN-dependent ubiquitylome in response to mitochondrial depolarization. Nature. 2013 Apr 18;496(7445):372-6. （IF=40.1）；Lenalidomide Causes Selective Degradation of IKZF1 and IKZF3 in Multiple Myeloma Cells. Science. 2014 Jan 17;343(6168):301-5. （IF=37.2）