基本信息
題 目 ：Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals
期刊：J.Cell Biol.
影響因子：7.955
主要技術：轉錄組學，蛋白質組，代謝組及聯合分析
研究背景
線粒體結構與功能的改變涉及人類100多種疾病,如退行性疾病、唐氏綜合癥、糖尿病、心臟病、衰老和癌癥等。線粒體是控制細胞凋亡的關鍵因素。這些都與線粒體基因組、轉錄組表達譜和蛋白質組表達譜有著密切的聯系。由于線粒體在能量生產、信號傳遞和新陳代謝等方面的重要作用，可以預測線粒體內存在值得期待的蛋白質?；虮磉_不僅僅是從轉錄組到蛋白質組的單向流動，而是兩者的相互連接。要了解轉錄組和蛋白質組之間的相互調控作用，需要對RNA和蛋白質的表達進行同步監測。通過分析四種線粒體應激處理后細胞轉錄組、蛋白質組和代謝組的變化，發現ATF4基因是線粒體應激調控的關鍵基因。
研究內容及結果
1. 線粒體應激處理后有效改變線粒體功能
作者分別用四種物質（doxycycline四環霉素、actinonin放線酰胺素，FCCP碳酰*-4-三氟甲氧基苯腙和MB（MitoBloCK））對Hela細胞進行處理，發現線粒體膜電位能力出現不同程度的改變，其中以FCCP的應激效果最好（Figure.1B），且除了doxycycline四環霉素處理外，其余處理都有效提高了線粒體的活性氧自由基（Figure .1C和D）。
2. 不同線粒體應激處理后轉錄組、蛋白質組、代謝組變化
作者分別用四種物質（doxycycline四環霉素、actinonin放線酰胺素, FCCP碳酰*-4-三氟甲氧基苯腙,和MB）對Hela細胞進行處理，時間24h，后通過轉錄組測序，蛋白質質譜分析（TMT）及高通量非靶向代謝組檢測技術（Figure 2A）。從轉錄組及蛋白質的分析結果來看，共鑒定出15174 轉錄本及8067個蛋白質，其中線粒體中的差異基因及蛋白分別占到1053及878個，占比分別為6.9%及10.8%。通過聚類分析結果顯示，與actinonin放線酰胺素, FCCP碳酰*-4-三氟甲氧基苯腙及MB誘導結果相比， doxycycline誘導效應相對較弱，不是很顯著（Figure 2C 和D）。
在FDR＜0.05的參數設置下，對不同誘導條件下的差異表達基因及蛋白進行統計分析鑒定（Figure 2E）。結果顯示，actinonin放線酰胺素和MB誘導條件下，轉錄組水平的誘導響應較為顯著，而在doxycycline四環霉素及FCCP碳酰*-4-三氟甲氧基苯腙的誘導下的Hela細胞，其蛋白質組水平誘導較為顯著。同時作者發現，在所有的誘導條件下，線粒體水平上的差異變化，蛋白質組層面比轉錄組層面的變化較為顯著，其線粒體差異基因表達量百分比約為其他基因的3倍左右（Figure 2E）。有效的證明了不同應激處理條件下線粒體在轉錄組層面及蛋白質組層面發生了有效的變化。
3. 不同線粒體應激處理導致氨基酸代謝途徑及生物合成途徑發生變化
作者通過對上調的基因和蛋白質進行分析驗證，發現59個基因上調，只有17個蛋白質上調（Figure.3A ），上調主要發生在轉錄組水平，并且集中在線粒體基因的上上調數為4個genes，2個蛋白質，說明了壓力誘導產生的表達量變化不集中在線粒體層面上。作者通過轉錄組及蛋白質組的KEGG富集分析結果中發現，主要集中與氨基酸代謝途徑（Fig.3B），尤其是絲氨酸代謝途徑相關的生物合成過程，并發現色氨酸合成過程上調的關鍵酶主要是PSAT1、PSPH及PHGDH以及SDSL。
4.不同線粒體應激處理改變細胞代謝產物
作者通過代謝組方法，研究4種不同處理條件下細胞代謝產物的變化。代謝組數據鑒定到約300個有注釋的代謝物質，通過聚類分析及熱圖的分析結果顯示，代謝產物趨勢與轉錄組和蛋白質組整體上趨勢保持一致。其中doxycycline四環霉素處理組產生的影響效果更加顯著。通過差異表達分析及富集分析顯示：不同應激處理后響應效果最明顯的為甘油磷脂及鞘磷脂代謝途徑（Figure.4B），并發現四種應激處理后明顯上調或下調的代謝產物基本保持一致，包括ceramide神經酰胺，CDP-ethanolamine乙醇胺，及幾種溶血磷脂酰膽堿lysophosphatidycholine 、lysophosphatidylethanolamine(Fig. 4D)。這些代謝產物的變化充分說明了絲氨酸代謝增加通過神經酰胺的效應有效促進了油脂及磷脂質的生物合成。
5. ATF4基因與不同應激處理協同變化
為了推測應激處理響應變化關鍵因素，作者采用HOMER分析方法對共同存在的上調基因進行Denovo motif分析，并得到高分motif，序列為5′-TTG CAT GACG-3′，其在靶基因中存在比例為17.65%，與ATF4、DDIT3/CHOP及CEBPB序列相似，其中ATF4得分率最高，極有可能是對應的轉錄因子（Figure.5B）并經免疫共沉淀方法進行驗證，同時進行驗證的還有CHOP。
作者同時發現約一半的由應激處理響應的基因同樣是ATF4轉錄因子對應的靶基因（Figure.5C）。為進一步驗證，作者采用CRISP-Cas9敲除技術，獲得ATF4缺失Hela細胞后，對其進行應激處理，發現其對應ASNA,CHAC1,PCK2,PSHP靶基因對應的缺失，并增強了ATP呼吸依賴性，說明其在線粒體功能調控上起重要作用。
6. 比較分析人及模型鼠群中ATF4途徑及線粒體脅迫間的遺傳效應
作者通過GTEx 小鼠居群數據進行mt-stress基因表達研究，并構建網絡分析圖，并對ATF4,DDIT3/CHOP和CEBPB轉錄因子做關聯分析，結果顯示mt-stress基因與BXD數據聚類關系較近，通過系列的驗證最終證明ATF4通過ISR激活效應調節細胞內代謝及線粒體功能，進而對外界脅迫刺激進行響應適應。
文章小結
通過轉錄組，蛋白質組及代謝組技術的單獨測序及關聯分析，對Hela細胞在四種試劑誘導下的樣品進行線粒體功能脅迫方面的分析比較，初步探討了線粒體應激脅迫響應途徑參與的相關基因，并發現ATF4是響應的關鍵因子，并通過在人及動物鼠模型中進一步的驗證比較尋求其調控機制，ATF4通過降低MRPs的表達水平，從而達到減弱轉錄能力的效果，從而有效適應外界脅迫條件，為研究線粒體功能障礙等相關疾病的研究探索提供了理論依據。
解析文獻
Quirós P M, Prado M A, Zamboni N, et al. Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals[J]. Journal of Cell Biology, 2017, 216(7):2027.
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