編者按
預測局部晚期肺癌患者或轉移性肺癌患者對化療或靶向治療的臨床應答，需要一種準確且可負擔的工具。在本研究中，研究人員利用了主要來源于惡性漿液滲出物的肺類器官模型（LCOs），準確預測了晚期肺癌患者對治療的臨床應答。
今天，我們關注一項廣東省人民醫院吳一龍教授、楊衿記教授團隊于2023年在Cell子刊Cell Reports Medicine（IF：16.988）發表的最新研究——《Using patient-derived organoids to predict locally advanced or metastatic lung cancer tumor response: A real-world study》，該研究利用肺類器官模型，根據其病理和分子特征驗證模型的可靠性，并利用藥物敏感性試驗（DSTs）的結果，制定了晚期肺癌的個性化治療策略，這也是目前全球范圍內已公開發表的zui大的肺癌類器官研究隊列。
論文翻譯：曾玲玲
01、研究背景
肺癌是診斷量第二大的癌癥，也是導致癌癥死亡的主要原因，在中國每年有超過60萬人死于肺癌。發展出惡性漿液性積液（MSE）的晚期肺癌患者的預后情況明顯較差，總生存期（OS）為5.49個月，而沒有MSE的患者為12.65個月。一種基于個性化因素和特定基因靶點制定治療方案的方法已被開發出來，以提高治療效果。分子靶向療法延長了晚期肺癌患者的生存期，提高了患者的生活質量。
目前，個性化治療方案的確定在很大程度上依賴于分子分析方法的結果，特別是下一代測序（NGS）。NGS可以檢測腫瘤驅動突變，然后使臨床醫生選擇特定的分子靶向藥物進行癌癥治療。分子測序歷來依賴于手術和穿刺活檢標本。研究表明，在惡性胸腔積液（MPE）樣本中檢測表皮生長因子受體（EGFR）突變的敏感性和特異性與在腫瘤組織樣本中進行的測量相當（>80%）。此外，MPE是檢測kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（KRAS）突變和間變性淋巴瘤激酶（ALK）重排的可靠樣本。使用MSE也可以檢測到任何新獲得的基因改變。
肺癌是一種復雜的疾病，在不同的患者中表現出表型和基因型的多樣性，這給精準醫學的應用帶來了相當大的挑戰。非小細胞肺癌（NSCLC）是研究最廣泛的肺癌亞型，盡管只有30%的患者攜帶可操作突變，但并非所有這些患者都能從靶向治療中獲益。另外，一些靶向抗癌藥物也有脫靶作用，還有，一些沒有可操作突變的患者可能受益于靶向治療藥物，如EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）或聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）抑制劑。因此，建立模擬原始組織形態學和基因組特征的臨床前模型來預測靶向治療的臨床結果勢在必行。
建立可靠的臨床前模型來評估腫瘤對化療或靶向藥物的應答一直是人們關注的焦點。這些模型包括細胞系，基因工程小鼠模型，器官型組織切片培養，和患者來源的異種移植物（PDXs）。雖然傳統的腫瘤細胞系可以用來建立臨床前模型，但由于缺乏細胞間的相互作用，它們不足以代表復雜的腫瘤。相反，PDX可以保留原始腫瘤的結構和遺傳特征，并模擬類似的腫瘤微環境。然而，PDX和基因工程模型都既昂貴又耗時，而且需要犧牲大量的實驗動物。因此，一個易于維持和擴增的臨床前模型對于轉化醫學至關重要?；颊邅碓吹念惼鞴伲≒DOs）使用三維結構，可以準確模擬腫瘤的異質性和多樣性，與原始臨床標本顯示出高度的基因型和表型一致性，對抗腫瘤藥物的應答反應可以模仿患者的預期反應，并且可以在短時間內獲得結果。
在以往的研究中，一系列器官的原發腫瘤已成功構建了類器官，包括結腸、子宮、卵巢、胰腺、乳腺等實體腫瘤。近年來，來自原發性肺腫瘤的類器官也有報道。過去，手術標本被用來建立肺癌類器官（LCOs），但這不易用于晚期肺癌。除了LCO的建立和驗證之外，研究還側重于開發自動化方法，如微陣列和微流控芯片，以便在短時間內進行基于類器官的藥物測試。最近的一項研究表明，使用肺腺癌（ADC）類器官進行靶向治療的應答結果與實際臨床應答高度相關，揭示了LCOs作為個性化醫療工具的潛力。
LCO培養的成功率在7%~87%之間，MSE可能是一個理想的來源。然而，基于LCO的藥敏試驗（LCO-DST）預測臨床應答的準確性尚不清楚。在這項研究中，本文研究人員成功地從腫瘤組織標本和MSE樣本中生成了160個LCOs。本文研究人員的目標是利用腫瘤組織或MSE樣本生成可行的LCO模型，并根據其病理和分子特征驗證模型的可靠性，利用藥物敏感性試驗（DSTs）的結果制定晚期肺癌的個性化治療策略。
02、主要研究成果
1、肺癌患者源性類器官的構建及病理分析
在本研究中，從2019年10月1日至2021年9月30日期間從107名晚期癌癥患者中收集了214份用于生成類器官的樣本。本文研究人員成功建立了162個PDOs（圖1A），成功率為75.7%。在排除了兩名乳腺癌患者的樣本后，160個樣本最終被納入后續深入分析。這些LCOs包括127例ADCs，10例鱗狀細胞癌(SCCs)，小細胞肺癌（SCLCs），12例腺鱗癌（ASCs），1例肺肉瘤癌。本組中的LCOs主要來自MSE（162例中的132例），包括胸膜液樣本（103例）、腹水樣本（15例）和心包積液樣本（14例）。此外，從手術切除的原發性或轉移性病變活檢中分離出18個標本，主要來自淋巴結。
本文研究人員試圖分析52例LCOs培養失敗的潛在原因。其中細胞不足是最常見的因素之一。此外，單因素和多因素分析顯示，病理和采樣類型是獨立的影響因素。使用肺腺癌和MSE更有利于培養成功。
采用蘇木精-伊紅（H&E）染色和免疫組化（IHC）對類器官進行驗證，并與原始組織進行形態學和病理學比較。免疫組化標記物選自常規用于肺癌亞型診斷的。H&E染色（圖1B）和IHC（圖1C-1E）顯示LCOs保留了原始腫瘤組織或MSE的組織病理學特征。例如，ADC衍生的LCOs聚集在一起，具有微妙的細胞學特征，如突出的核和立方核形態，能形成腺泡結構，并保留了原發ADC組織的特征（圖1B）。
此外，ADC衍生的LCOs會表達經典的ADC標志物，包括細胞角蛋白7（CK7）、甲狀腺轉錄因子1（TTF-1）和napsin A（圖1C）[43]。SCC衍生的LCOs來自手術切除的肺病變（P-106），其IHC指標P40、P63和CK5/6表達強烈（圖1D）。而來源于SCLC的LCOs細胞形態小，周質少，可以表達CD56、突觸素（Syn）、CgA和TTF-1等神經內分泌標志物（圖1E）。這些數據表明，LCOs可以保持原發腫瘤的形態學和病理學特征，并反映其個體特征。
原文圖1 LCOs構建流程圖及其病理學分析
2、MSE與MSE衍生LCOs基因組圖譜的一致性
對25例患者進行了NGS檢測，以檢測LCOs與原始樣本之間基因譜的一致性。對積液和LCO樣本進行體細胞突變譜分析。積液中的變化和與之相匹配的LCO樣本的變化，如圖A所示。
總的來說，在積液樣本中鑒定出共有157個體細胞變異，其中涉及到77個基因，包括100個單核苷酸變異（SNVs）、11個indels、28個拷貝數變異（CNVs）、4個大基因組重排（LGRs）和14個融合子。腫瘤蛋白53（TP53）、EGFR和視網膜母細胞瘤1（RB1）是最常見的突變基因，分別出現在69%（n=18）、69%（n=18）和19%（n=5）的積液樣本中。
此外，在LCO樣本中鑒定出143個體細胞突變，涉及73個基因，包括93個SNVs、11個indels、26個CNVs、4個LGRs和9個融合子。EGFR、TP53和RB1是最常見的突變基因，分別發生在65%（n=17）、58%（n=15）和15%（n=4）的LCO樣本中。在這些變異中，64個突變（30.9%）為積液特異性，50個（24.2%）突變是LCO特異性的，93個（44.9%）突變在兩種介質中共有。積液和LCO樣品的變異檢出率具有可比性（96.2% vs 80.7%，p=0.19）。
在積液和LCO樣本中，最大等位基因頻率的中位數無顯著差異（31.1%對34.0%，p=0.98，圖2B）。接下來，分析了MSE和LCOs之間體細胞變異的一致性。在20例存在體細胞變異的積液和LCO樣本中，在積液和LCO樣本中均檢測到93例體細胞變異，39例為積液特異性變異，41例為LCO特異性變異。當以匹配的積液樣本的基因組圖譜作為參考時，這些數據導致LCO樣本的變異敏感性為70.5%（132例中有93例），陽性預測率為69.4%（134例中有93例，圖2C）。11例匹配的LCOs和積液標本存在腫瘤突變負荷（TMB）。在兩種介質之間觀察到相似的TMB（兩者均為1.99個突變/Mb，p=0.89，圖2D）。此外，基于LCO的TMB與基于積液的TMB呈正相關‘（圖2E）。
總的來說，這些發現揭示了積液和LCO樣本之間的基因組圖譜可接受的一致性。
原文圖2 LCO樣本的基因組分析
3、LCOs可預測對靶向治療的個性化應答
在大多數患者中，治療方案是基于遺傳特征和既往治療等因素進行個性化的。此外，體外藥物篩選策略也針對個別患者量身定制。將臨床方案與LCO-DST結果相同的36例患者的54例LCOs分為4類：奧西替尼組、化療組、雙靶向治療組和其他靶向治療組。
通過受試者工作特征曲線（ROC）分析LCO-DST來區分臨床敏感或耐藥患者的能力。預測指標是LCO對奧西替尼、化療、雙靶向治療和其他靶向治療的敏感性。應答的一致性分別為86.7%（13/15）、83.3%（10/12）、100%（10/10）和70.6%（12/17），LCODST的總體敏感性為84.0%（95%CI, 63.08%-94.75%），特異性為82.8%（95%CI, 63.51%-93.47%），準確性為83.3%（圖3A、3B）。來自4例患者的6個LCOs的藥物反應熱圖顯示，患者對抗癌藥物的反應存在個體差異，而來自同一患者的不同LCOs之間的反應具有相對較高的一致性?；熕幬锏陌霐底畲笠种茲舛龋↖C50）值一般高于靶向治療劑。
在奧西替尼組中，12例患者選擇奧西替尼作為下一線治療藥物（圖3C），并對這些患者產生的15例LCOs進行了奧西替尼敏感性測試（圖3D）。一般情況下，進展組（PD）和部分緩解組（PR）的IC50可以明顯區分，ROC分析的曲線下面積（AUC）值為0.94（圖3E和3F）。使用LCO-DST可以準確預測大多數患者的臨床反應。例如，P-41被診斷為EGFR 19del的IVA期ADC。一線治療是伊可替尼。PD后，LCO-DST提示奧西替尼的潛在有益作用（IC50=0.10 μM）。在現實中，奧西替尼用于該患者的后續治療，并實現了持續的PR（圖3G）。
此外，LCO-DST還可以預測對靶向治療藥物的耐藥性。EGFRT790M被發現，并且根據臨床指南選擇奧西替尼作為下一步治療藥物。然而，LCO-DST顯示體外對奧西替尼耐藥（IC50=4.37 μM）。遺憾的是，該疾病僅在4.5個月的時間內便迅速發展（圖3H）。此外，這些結果表明腫瘤體積的減小與IC50值相關，表明該方法也可以預測抗癌治療后的預后情況。
4例ALK融合患者被納入LCO-DST分析，包括1例未治療患者和3例治療患者。所有LCO-DST結果均與臨床反應一致（100%，5/5）。例如，P-63被診斷為IVA期ADC，其含有棘皮微管相關蛋白樣4（EML4）-ALK融合基因。第二代ALK-TKIs，色瑞替尼和SAF-189s，先后實現了33.7和22.8個月的PFS。在進行二線治療進展后，使用MPE樣本進行LCO-DST來預測對艾樂替尼的耐藥性。SAF-189s在體外也無效（圖3I和3J）。然而，在決定下一步治療方案時，并未考慮LCO-DST；艾樂替尼仍被確定為三線治療藥物。顱內轉移瘤顯著增加，這導致疾病的惡化。另一個病人ALKfusion（P-27）先前對艾樂替尼有耐藥性，在LCO-DST中顯示對艾樂替尼不敏感。
這些結果表明，LCOs可以預測未經治療和接受治療的患者對靶向治療的臨床反應。盡管每種藥物試驗的方案是有限的，可能無法準確表明哪種治療方法更好，但對于這些患者來說，可以避免因不必要的副作用、時間消耗和資源消耗而導致的無效治療仍然至關重要。
4、LCOs預測對化療的個性化反應
LCO藥物篩選試驗結果與對化療的真實臨床反應之間的相關性已有報道。在這里，本文研究人員報告了9名被推薦化療作為下一步的療程的患者的數據。其中，4例患者患有ADC，并接受了TDM1（P-85），nab-紫杉醇(P-81)，培美曲塞和卡鉑（P-25）和EP治療（依托泊苷和順鉑）（P-3）的治療。4例SCLC患者中有3例接受EP治療（P-50、P-65和P-83），P-73接受nab-紫杉醇治療。
在接受EP治療的患者中，P-3被診斷為ADC，而其他患者被診斷為SCLC。他們采用相同的治療方案，但結果不同。P-3和P-65均達到PR，而P-50和P-83均達到PD。實際的臨床反應是由LCO-DSTs預測的，EP治療抑制了P-3和P-65衍生的LCO，但未能抑制P-50和P-83衍生的LCO（圖3K）。這些結果提示，LCOs對化療藥物的體外檢測可以反映臨床對化療的反應。
原文圖3 基于LCO的藥物篩選與臨床應答的比較
5、從多個樣品中得出的LCOs顯示出穩定性和異質性
除了模型的成功率和純度之外，使用腫瘤類器官進行藥物篩選的另一個挑戰是實驗穩定性。腫瘤間和腫瘤內的異質性已被廣泛考慮。在本研究中，本文研究人員收集了來自同一患者的不同樣本，以探索LCO藥物反應的穩定性和異質性。首先，提取患者不同時間點的MSE樣本，建立LCOs，并進行DSTs。
隨著采樣時間的延長，細胞數量呈減少趨勢，但不影響LCO模型的建立。對不同培養時間LCO樣品進行基因組圖譜分析。不同采樣時間間隔為1~9天。P-51在第1、2、3天采集了3份LCO樣本。P-78和P-100分別在第1天和第2天采集了2個LCO樣本。P-101在第4天和第9天采集了兩個LCO樣本。對于P-51，3個LCO的體細胞變異一致性為81.25%（16個LCO中的13個），僅在第1天收集的LCO中檢測到MYC擴增和WT1擴增，而在第3天收集的LCO中未檢測到IL7R擴增。此外，從其余三名患者（P-78、P-100、P101）獲得的LCO樣本中也觀察到相同的變化。總的來說，這些發現表明在不同采樣時間獲得的LCO樣本之間的基因組譜具有高度一致性，這表明LCO可能是一種優化的穩定的NSCLC體外模型（圖4A）。
接下來，本文研究人員研究了來自5名患者的組織樣本、積液樣本和LCOs基因組圖譜的一致性。在P-51中，腫瘤組織樣本中檢測到13個SNVs，在MSE和LCOs中均檢測到12個SNVs；然而在MSE和LCOs中僅檢測到12個CNVs中的2個（圖4B）。在P-87和P-96中也觀察到組織和積液/LCO樣本之間SNVs的高度一致性（圖4C和4D）。在P-60和P-100中觀察到組織和積液/LCO樣本之間CNVs的一致性較低（圖4E和4F）。這些發現表明SNVs，而不是CNVs，可以在積液/LCO樣品中被準確地檢測到。
在連續樣品中，LCO的體外藥物反應保持穩定。P-51患有晚期SCC，連續3天收集了大量MPE。MPE的細胞密度隨著時間的推移而下降，類器官形成的數量也受到影響，盡管LCO培養物中的細胞密度保持不變（圖4G）。LCO-DST對不同樣品的檢測結果穩定。nab-紫杉醇聯合對3種LCOs的抑制作用最小，臨床上也被證明無效，而磷酸肌苷3-激酶(PI3K)的抑制劑GDC-0941的抑制作用更強（圖4H和4I）。從MSE樣品中獲得的LCOs似乎與組織來源的LCOs有很大的差異，例如從P-33的MPE中獲得的LCOs松散且不規則。來自同一患者淋巴結的LCOs形狀更緊密，更規則（圖4J）。
淋巴結來源的LCOs對DST也更敏感（圖4K），接受艾樂替尼治療的患者臨床評價達到PR，與藥敏試驗結果一致（圖4L）。在不同MSE樣品的情況下，LCO-DST往往表現出相同的劑量-效應關系。例如，從MPE和腹水積液中采集兩個樣本，LCOs的形態特征略有不同：MPE來源的LCOs呈液泡狀和實狀，而腹水積液來源的LCOs呈實狀（圖4M）。腹水積液來源的LCOs的DST敏感性略高于MPE來源的LCOs，但兩者敏感性差異不顯著（圖4N）。
原文圖4 LCO的穩定性和異質性
6、LCO藥物篩選可代表雙靶向治療的臨床反應
在晚期肺癌患者中，對單一抗癌藥物的耐藥性是常見的。LCO-DST對體外預測聯合治療效果有一定的指導意義。在本研究中，有幾個病例表現為進行性肺部疾病。獲得LCOs，并對聯合治療方案進行測試。P-60診斷為IVB期肺ADC（圖5A），基線時腦脊液中檢測到EGFR L858R突變和MET拷貝數增加。
該患者服用奧西替尼后出現頭暈、嘔吐加重伴腦轉移灶擴大；看來奧西替尼可能不是最佳選擇。成功培養了一個淋巴結來源的LCO（P-60-O1T），三個心包積液來源的LCO（P-60-O2E、P-60-O3E和P-60-O4E）分別在第1、4、5天，并進行DST（圖5B）。在這4種LCOs中，奧西替尼聯合賽沃替尼的IC50分別為1.32、0.71、0.25和0.24。對比奧西替尼（1.82、1.15、0.25、1.30）和賽沃替尼（僅在P-60-O3E和P-60-O4E中進行，分別為11.59和17.61）的IC50，結果顯示，對于該患者，奧西替尼聯合沙伐替尼可能優于奧西替尼或沙伐替尼單藥治療。
有趣的是，由于MET擴增在MSE和LCO中通過熒光原位雜交（FISH）、免疫熒光染色和免疫組化（IHC）被進一步證實（圖5C、5D），并證實了PR（圖5E），所以給予患者奧西替尼聯合賽沃替尼治療。P-61被診斷為IVA期肺ADC，基線是EGFR 19del（圖5F）?；颊咭颢@得性T790M突變，而接受了伊可替尼的一線治療和奧西替尼的二線治療。在出現耐藥性后，患者接受了雙靶向治療，包括奧西替尼和卡博替尼。雙藥聯合治療45天后腫瘤評估顯示PR（圖5G）。
NGS證實在轉染（RET）-CCDC6融合過程中，除了EGFR 19del和T790M外，還存在重排蛋白（圖5H）。同期胸腔積液（P-61-O1E、P-61-O2E、P-61-O3E）和腹水積液（P-61-O4E、P-61-O5E）來源的LCOs的DST顯示，奧西替尼聯合卡博替尼的IC50分別為0.15、0.22、0.16、0.33、0.44，而奧西替尼聯合BLU667的IC50分別為0.03、0.02、0.01、0.03、0.24，表明奧西替尼聯合卡博替尼/BLU667可顯著抑制腫瘤生長（圖5I）。這些病例提示LCO-DST具有預測有效聯合治療方案的潛力。
原文圖5 LCOs預測耐藥病例的雙靶向治療
7、LCOs的蛋白質組學圖揭示了雙靶向治療的分子機制
盡管EGFR和RET抑制劑聯合治療的效果已在LCO藥物篩選試驗中得到證實，但其潛在的分子機制尚不清楚。因此，選擇進行4Dlabel-free高通量蛋白質組學分析。本文研究人員在287,153個光譜中鑒定出39,312個獨特的肽段。總共鑒定了4865個蛋白質，其中4833個被定量。
將定量蛋白又分為4組（4818、4787、4785和4833），類器官分別用奧西替尼、BLU-667聯合奧西替尼、BLU-667（聯合組）和0.1%二甲亞砜處理。主成分分析（PCA）結果顯示，不同處理組的表達水平不同，表明不同的效應（圖6A）。在差異表達蛋白（DEPs）方面，與對照組相比，聯合治療有119個蛋白發生了顯著改變，包括26個上調蛋白和93個下調蛋白（圖6B）。然而，當使用單一藥物奧西替尼或BLU-667治療時，DEPs的數量分別為154個（圖6C）和285個（圖6D）。從DEPs的細胞定位上來看，三個處理組的蛋白表達趨勢相同，其中DEPs中核蛋白數量最多，其次是細胞質蛋白和細胞膜蛋白。這些結果表明，三種處理方式對蛋白表達的改變旨在調節細胞核功能，包括基因表達。
就DEPs的功能而言，幾個蛋白家族的改變與腫瘤細胞的存活密切相關。奧西替尼與BLU-667聯用后，導致觸發細胞凋亡的關鍵因子caspase 3的表達顯著增加，而caspase家族其他成員caspase 8、caspase 10的表達在經聯合方案處理后表達也增加（圖6E）。由于常見的下游級聯反應，RET重排是EGFR-TKI耐藥的關鍵因素。RET TKIs還聯合第三代EGFR-TKI奧西替尼作為EGFR-RET雙突變患者的治療方案。
然而，潛在的分子機制尚不清楚。通過4D液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）的蛋白質組學分析顯示，EGFR和RET的下游蛋白如RAC、PI3K、MEK的表達下調（圖6F），表示其參與了腫瘤細胞存活。治療中改變的另一個關鍵通路是Hippo通路，該通路對腫瘤的生長和存活至關重要。BLU-667和奧西替尼單獨或聯合治療均顯著降低了MOB1和MST1/2水平。在BLU-667和奧西替尼聯合治療后，存活相關基因的關鍵轉錄因子YAP水平下降（圖6G）。這些結果表明，與單一試劑處理相比，聯合處理會顯著觸發細胞死亡的情況。
原文圖6 胸膜液衍生類器官的蛋白質組學分析表明耐藥機制
03、編者點評
根據遺傳譜和其他生物標志物的結果制定治療策略存在局限性[44,45]。在許多情況下，特別是對原發性耐藥患者，對治療反應的分子機制或缺乏分子機制尚不清楚。因此，在使用精準醫學治療肺癌時，尋找到可準確預測臨床反應的方法勢在必行。
先前的研究表明，MSE衍生的類器官和其他體外模型是預測臨床治療療效的潛在材料。本文研究人員的研究結果表明，LCO模型為兩種目標的應用提供了一個個性化的平臺，對于晚期肺癌患者的治療和化療。在本文研究人員的隊列中共建立了162個類器官，其中大部分來自MSE樣本。組織源性類器官和MSE源性類器官的成功率分別為57.8%（30/52）和81.4%（132/162），這意味著MSE可以提供彌補這一成功率差距的機會。從核心穿刺活檢和淋巴結切除獲得的類器官培養物中，腫瘤細胞計數通常不足。此外，從手術和活檢樣本中獲得的模型的一個限制就是正常氣道上皮細胞的過度生長。
然而，MSE主要由腫瘤細胞組成，而不是非惡性上皮細胞或間皮細胞，可以通過相對微創的方式獲得。因此，MSE衍生的LCOs往往是更純粹的腫瘤類器官，使這些模型成為DST的優秀候選者。來自組織或MSE樣本的LCOs真實地反映了原始腫瘤的病理和分子特征，這些結果為后續的DST提供了可靠的基礎。LCO-DST結果與臨床治療反應高度一致，該方法有望作為一種重要的預測工具，可用于個性化醫療，建立個性化的肺癌治療方案。
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