還在為PCR實驗速度過慢，影響實驗進展而煩惱嗎？

還在為檢出率低，反復PCR驗證而苦惱嗎？

翌圣明星產品

快速PCR試劑（Cat#10167ES）

速度快至1 s/kb，專為您解決煩惱！

話不多說，小翌直接上數據！

各擴增酶實際上機用時總時長（包含PCR儀升溫、降溫過程）。

10167ES擴增3 kb片段上機時間僅需59 min！30循環下，6 kb片段上機僅需58 min！相比市面上其他產品，最高立省3.7小時！

以下更有詳細實驗操作解析，今日免費公開！助力實驗黨高效完成實驗！

實驗材料：

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DNA樣本：大腸桿菌菌落、大腸桿菌菌液、農桿菌菌落、酵母菌落、小鼠基因組DNA、玉米基因組DNA、水稻基因組DNA。

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快速PCR試劑：2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix（Cat#10167ES）。

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其他試劑：RNase-free H2O或DEPC處理水、相關基因上下游引物(儲存濃度10 μM)。

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設備與耗材：移液器、PCR儀、冰盒、離心機、EP管、RNase-free離心管。

實驗步驟：

01

試劑&樣本前期準備

試劑解凍和混勻

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從冰箱中取出：

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從-20℃冰箱中取出含酶試劑，立即放入冰盒中（冰上操作）。

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避免將試劑直接放在室溫下解凍，以免溫度波動影響酶的活性。

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緩慢解凍：

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讓試劑在冰上自然解凍，通常需要5-10分鐘。

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如果需要快速解凍，可以將試劑握在手中輕輕搖晃，但不要過度加熱。

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低速離心：

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PCR Mix在1×預混液中含有2 mM Mg2+和200 μM的dNTPs，使用前要充分解凍混勻。

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將試劑管短暫離心（5-10秒，1000 rpm左右），使管壁和管蓋上的液體集中到管底。

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離心后置于渦旋儀震蕩10 sec混勻，確保試劑均勻分布。

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混勻后的試劑應繼續放在冰上，避免長時間暴露在室溫下。

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如溶解后，暫未使用，可暫時儲存于4度放置。

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Tips：混勻時盡量避免產生氣泡，氣泡可能會影響酶的活性或實驗結果的準確性。

02

模板稀釋（若需要）

以下是針對不同模板，PCR反應時推薦的使用量：

用無菌超純水稀釋DNA或者線性化載體至目標濃度。

Tips：模板DNA在儲存的過程中會有一定程度的降解，儲存前測試的濃度不一定準確，為了保證實驗精度，在放置一段時間后，需重新測試DNA模板濃度。

03

不同模板擴增1 kb目的片段比對測試

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以大腸桿菌菌落、農桿菌菌落為模板：盡量使用新鮮長滿的平板，大腸桿菌、農桿菌平板4度存放不得超過45天。

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以大腸桿菌菌液為模板：使用新鮮搖菌的大腸桿菌菌液。挑取單菌落至1 mL液體培養基中，37℃搖床180 rpm培養3-4 h，至菌液渾濁但偏澄清的狀態，使用分光光度計測試OD600下的菌液濃度，OD600=0.5-0.6最佳。

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Tips：OD600不宜超過1.2，菌液太濃會抑制擴增。

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以小鼠、玉米、水稻基因組DNA為模板：根據10167ES說明書中基因組添加量進行樣本稀釋，本實驗預計添加的樣本量為100 ng，將基因組DNA均稀釋為50 ng/μL。

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加樣順序：RNase-free H2O＞引物＞模板＞PCR Mix。

引物作為反復凍融使用的材料，在使用過程中易造成污染，導致非特異擴增。所以建議引物作為ddH2O之后優先添加的材料，防止因槍頭未更換等因素污染引物。

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菌落挑取方法：在環境中用10 μL槍頭蘸取菌落后，槍頭插入溶液中，移液器按鈕從第一檔按至第二檔打出，反復吹打三次，確保菌落加入反應體系。（在透明的水中含有些微白色物質，即可確認菌落已加至反應體系中。）

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菌液加樣方法：加樣前需上下顛倒混勻，用200 μL槍頭吹打混勻。

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PCR反應體系：

試劑混勻

配制完成后，用桌面離心機瞬離所有試劑到管底，然后渦旋10 sec振蕩混勻，若期間有氣泡，要將氣泡輕輕指彈震裂，離心10 sec后立即上機。

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若暫時不能上機，可于-20℃暫存1 h。

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各擴增酶Mix PCR反應程序

10167ES反應程序

P*反應程序

N*反應程序

V*反應程序

T*反應程序

*推薦退火溫度：60°C，也可根據自身需要設立溫度梯度摸索引物退火的最適溫度。推薦退火時間設置為20 sec，可以在10-30 sec內調節。但需注意退火時間過長可能導致擴增產物在膠上呈彌散狀。

**延伸速度設置可參考下表：本次擴增目的片段均為1 kb左右，因此設置為1 sec/kb。

如需提高產量可適當延長延伸時間，不宜超過30 sec/kb。

***循環數可設置為30-35個循環。無需再增加循環數。因為過多的循環雖然能增加產物量，但會導致非特異性產物擴增和假陽性的風險。

Tips：隨著副產物的積累以及試劑的消耗，即使再增加循環數，PCR產物量也不會再有明顯增加，出現擴增無法持續的停滯現象。10167ES試劑可以抑制【擴增無法持續的停滯現象】，無需再增加循環數，即可獲得高得率的PCR產物。

凝膠電泳

配制1%瓊脂糖凝膠插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反應液上樣（翌圣PCR試劑已含有紅色示蹤染料，無需添加loading buffer，可直接上樣）。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES），上樣4 μL。150 V電泳30 min，觀察電泳條帶。

Tips：移液槍斜角45°懸空插入膠孔中，緩慢加樣，確保玫紅色的PCR產物沉入膠孔中。避免戳破膠孔底部，導致樣品滲漏?？奢p微晃動電泳槽觀察凝膠是否漏液。

電泳結果

注：1：大腸桿菌菌落；2：大腸桿菌菌液；3：小鼠基因組DNA；4：玉米基因組DNA；5：水稻基因組DNA；6：農桿菌菌落。

結果顯示，翌圣快速PCR試劑（10167ES）性能優于市面上其他競品，擴增速度快，檢出率高，擴增產量高。

04

以酵母菌為模板擴增3 kb目的片段比對測試

樣本前處理

用10 μL槍頭挑取酵母菌平板上的單菌落，在裝有50 μL無菌水的1.5 mL離心管中吹打三次，放入微波爐高火加熱5 min，立刻用鑷子夾取至-80℃冰箱冷卻，即獲得酵母菌前處理液。

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酵母菌前處理液可以放在4度保存7天。

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酵母菌平板在4度存放不得超過45天。

PCR加樣

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加樣順序：RNase-free H2O＞引物＞酵母菌前處理液＞PCR Mix。

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菌液加樣方法：盡量使用新鮮處理的酵母前處理液，加樣前需解凍，震蕩10 sec混勻。

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PCR反應體系：

試劑混勻

配制完成后，用桌面離心機瞬離所有試劑到管底，然后渦旋10 sec振蕩混勻，若期間有氣泡，要將氣泡輕輕指彈震裂，離心10 sec后立即上機。

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若暫時不能上機，可于-20℃暫存1 h。

PCR反應程序

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（同3.“各擴增酶Mix PCR反應程序”），本次擴增目的片段為3 kb左右復雜模板，因此翌圣快速PCR（Cat#10167ES）延伸速度設置為1 sec/kb。

凝膠電泳

配制1%瓊脂糖凝膠插小孔梳，PCR完成后，吸取6 μL反應液上樣。Marker使用GoldBand DL10,000 DNA Marker（10505ES），上樣4 μL。150 V電泳30 min，觀察電泳條帶。

電泳結果

結果顯示，翌圣快速PCR試劑（10167ES）酵母擴增性能優于市面上其他競品，擴增速度快，檢出率高，擴增產量高。

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