3X FLAG peptide 是帶有 FLAG 標簽的多肽，包含三個重復的 Asp-Tyr-Lys-Xaa-Xaa-Asp 基序。3X FLAG peptide 可用于蛋白分離純化，和目標蛋白競爭性洗脫。
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體外研究
1. 通過 3X FLAG peptide 競爭純化 FLAG 標簽蛋白
(1) 質粒轉染：將 FLAG 標記的 mIRS-1、hIRS-1 或其突變體的質粒轉染到 293 T 細胞中，轉染時間為 2 天。
(2) 收集細胞：在 4 °C 下以 14,000 rpm 離心 10 分鐘收獲細胞，并用 HEPES 緩沖液 (150 mM NaCl、50 mM HEPES、pH 7.4、5 mM EDTA、1% (w/v) 脫氧膽酸鈉、1% (v/v) Triton X-100、0.2% 氟化鈉、0.1% 原釩酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物) 裂解細胞。
(3) 利用 Anti-FLAG 磁珠進行蛋白分離與純化：在細胞裂解液中加入Anti-Flag 磁珠 (HY-K0207)/Anti-c-Myc 磁珠 (1 μm) (HY-K0207A)，在室溫下孵育 2 小時或在 4 °C 下孵育過夜。隨后用洗滌緩沖液進行洗滌，并用含有 1 mg/mL 3X FLAG 的緩沖液進行洗脫。最后使用增加柱進行凝膠過濾以進一步純化上清液，該柱使用儲存緩沖液平衡。所有純化的蛋白質均通過離心過濾濃縮，并分裝儲存在 -80 °C 下。
(4) 蛋白定量與驗證：使用 ND-2000 NanoDrop 分光光度計以 OD 280 對純化的蛋白進行定量，并通過考馬斯亮藍染色進行驗證。
2. 通過 3X FLAG peptide 進行 Co-IP 和 co-IP–MS 分析
(1) 將細胞裂解液以 13300 rpm 在 4 °C 離心 15 分鐘，去除完整細胞。
(2) 上清液用對照免疫球蛋白 G (IgG) 或一抗在免疫沉淀緩沖液 (150 mM NaCl、20 mM HEPES、pH 7.4、1% Triton X-100、12.5 mM β-甘油磷酸鹽、1.5 mM MgCl2、2 mM EGTA，含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑) 中過夜孵育，然后在 4 °C 下與 20 μL 重懸的 A/G 蛋白珠孵育 2 小時，以沉淀結合的蛋白質。
(3) 對于連續免疫沉淀，在 4 °C 下用 5 倍凝膠體積的 3X FLAG 洗脫溶液 (終濃度 150 ng/mL) 孵育 2 小時，從珠粒中洗脫結合的蛋白質，然后在 4 °C 下用二抗免疫沉淀過夜。珠子在 4 °C 下以 1000 g 離心 5 分鐘，以去除上清液，用免疫沉淀緩沖液洗滌 4 次，并在 95 °C 下煮沸 20 分鐘。
(4) 樣品在 SDS-PAGE 凝膠上運行，然后染色 (Bio-Rad)。隨后，切下膠帶，脫色，胰蛋白酶消化，并進行 MS 分析，使用液相色譜-MS 確定個別蛋白質。