編者按
類器官技術自問世以來，推動了人體器官發育、疾病和精準醫療相關研究的進度。人源的肺、胃、肝、腎和前列腺等正常和癌類器官構建方法相繼被系統的建立起來，截至本文發稿前，人乳腺正常和癌類器官的構建方法還沒有被系統的描述過。
今天我們回顧一項于2021年3月10日發表在《Nature Protocols》的研究——《Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids》。作者系統描述了人乳腺正常和癌類器官構建、傳代和凍存方法，并介紹了基于類器官的基因操作和異種移植。作者成功構建起包含人乳腺正常和癌類器官共45例的生物庫，總結了乳腺類器官構建、傳代的特點和類器官的形態特征，并進一步鑒定了正常類器官的細胞群體組成。
一、研究背景
乳腺癌（breast cancer, BC），是女性群體中常見的高發癌癥之一，致死率在眾多惡行腫瘤中排名第二。由于上皮細胞的突變積累，乳腺癌包含多種亞型，具有較強的生物異質性。
目前臨床的治療手段選擇主要基于患者的臨床和病理特征結合雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER2）的表達狀況，因此無法充分適應個別患者的需求。而基于類器官技術構建起來的人乳腺正常和癌類器官為研究乳腺的器官發育、腫瘤發生和治療方案篩選提供了一種具有潛力的體外模型。
二、主要研究成果
1、人乳腺正常和癌類器官構建、基因操作和異種移植方法搭建
作者首先系統描述了人乳腺正常和癌類器官構建、基因操作和異種移植的具體步驟以及注意事項。
在類器官構建部分，主要流程涉及到合格樣本組織的獲取、 組織處理及消化、類器官構建、類器官傳代與凍存。在基因操作部分，作者介紹了3種轉染方法，分別是：陽離子脂質體法、電轉法和慢病毒包裝法，轉染后經過抗性篩選和克隆挑選，獲得轉染后的類器官。在異種移植部分，作者經過類器官擴增并收集形態完整的類器官，小鼠經提前皮下植入雌激素緩釋片后原位注射類器官，一段時間后可觀察到腫瘤形成。
原文圖1 人乳腺正常和癌類器官構建、基因操作和異種移植概覽圖
2、類器官的構建和傳代
作者針對人乳腺標本可能存在的脂肪層較厚的情況，指出在樣本處理時可先除去脂肪層，以免影響后續的消化效果。脂肪層區別于質地較硬的腫瘤組織，呈現質軟，顏色由白色到黃色不等的外觀特征，可較輕松的分離除去。
消化體系作者選擇膠原酶添加Rock抑制劑-Y27632，在將組織切碎到0.5-1毫米見方的基礎上，正常組織消化2h，腫瘤組織消化0.5-2 h，至少每30 min觀察取出消化混合物鏡檢觀察，消化結果以5-20個細胞組成的細胞團為好，消化終點用加入胎牛血清終止消化。過篩步驟作者建議反復過濾篩上截留組織碎塊至少3次，以增加細胞得率。種膠密度作者推薦，離心后在15 mL離心管底部形成的細胞沉淀厚度約為50 μL液體高度時，添加200 μL膠。若選擇12 孔板種膠，每孔種入100 μL膠，點成5-8個膠滴。倒置在孵箱內固化可以減少大的細胞團沉底貼壁的風險。膠固化后，每孔加入培養基750-1000 μL。作者推薦新構建的樣本同時使用兩種擴增培養基以確定最佳培養條件（詳見原文）。
乳腺類器官生長較慢，一般需要2-3 周才能生長至匯合狀態，作者推薦傳代比1：2，以細胞團狀態傳代為好。
原文圖2 類器官的構建、培養和傳代
3、乳腺癌類器官的鑒定
作者指出，乳腺癌類器官培養成功率約在55%-70%，不同分型的乳腺癌樣本培養成功率有差異，成功率最低的時是三種受體（ER、PR、HER2）表達陰性的分型，只有40%左右。長成后的癌類器官在形態上呈現出實質（約占60%）、葡萄串樣（約占20%）、囊泡狀（約占5%以下）和混合狀（約占20%），大小均能長到100 μm左右。不同患者來源的類器官生長速度差異較大，最慢的會有4周1：2傳代，最快的甚至可以達到每周1：6傳代。
在病理染色時，作者發現約20%的類器官長成后會出現和親本組織無法對應的受體表達丟失或受體表達獲得，作者猜測可能和培養基中某些因子誘導的突變有關。
原文圖3 乳腺癌類器官的鑒定
4、人乳腺正常類器官的形態特征和細胞組成
作者表明，正常乳腺類器官構建成功率較高，幾乎都能構建起來，但后期生長速度慢，最快約每兩周1：2傳代，且潛力有限，容易在培養過程中狀態變差死亡。
長成的人乳腺正常類器官大致有三種形態：成熟的管腔狀（ML）、小空泡的管腔祖細胞（LP）和有芽和分支結構的基底細胞（Basal），不同形態的類器官代表了不同的細胞群體，質譜流式結果 也證實了不同細胞群體分布在類器官中。作者還給出了某些關鍵因子的調整可以帶來細胞群體比例變化的結果。
原文圖4 正常乳腺類器官的形態及其細胞構成
5、對人乳腺正常類器官的基因操作
作者利用三種方法轉染正常類器官：分別是陽離子脂質體法、電轉法和慢病毒包裝法。在轉染操作中，作者推薦使用10萬-20萬細胞，并盡量消化成單細胞狀態，種回膠滴時使用正常傳代密度2倍左右的高密度種膠，轉染后通過熒光表達評價結果，并利用抗性篩選優化轉染后類器官的密度。
原文圖5 對正常類器官的基因操作
6、腫瘤類器官的異體移植
作者推薦使用每百萬細胞注射一個位點，且在收獲類器官時盡量保證類器官的形態完整。小鼠預先皮下植入雌激素緩釋片，以提供促進腫瘤植入和生長的外源性雌激素來源，收獲的類器官通過原位注射方式移植到小鼠體內，一段時間后觀察成瘤情況。作者還通過在移植液中注入臺盼藍，然后進行解剖，以確定其在乳腺墊中的定位。
原文圖6 人乳腺癌類器官的異體移植
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參考文獻
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