編者按

 西洋參（Panax quinquefolium L., AG）是一種具有多種心血管保護作用的中藥。這些年來，人們在 AG 中發現了許多生物活性成分；然而，研究者們對這些抗心力衰竭活性的關鍵藥效學成分的理解是不夠的。

今天，我們分享2022年10月由山東第一醫科大學、山東省醫學科學院研究團隊發表在《Frontiers in Pharmacology》的一項研究成果——Identification of key pharmacodynamic markers of American ginseng against heart failure based on metabolomics and zebrafish model，該研究建立了斑馬魚心力衰竭模型，評價西洋參的抗心力衰竭活性，并通過基于超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱-質譜技術（UHPLC-QE-Orbitrap-MS）的非靶向代謝組學分析對AG樣品中的差異組分進行了篩選，使用斑馬魚模型驗證了其潛在的活性成分；同時，利用網絡藥理學和分子對接技術預測了可能的機制。最后，研究人員使用定量實時聚合酶鏈反應 (Q-PCR) 技術在斑馬魚中驗證了六種關鍵藥效學成分的關鍵靶點。通過鹽酸維拉帕米處理，成功建立了受精后（hpf）斑馬魚幼魚48 h的心力衰竭模型。

斑馬魚試驗表明，AG的抗心力衰竭作用因產區而異。基于 UHPLC-QE-Orbitrap-MS 的草藥代謝組學分析結果表明，人參皂甙Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙Rg6、蘋果酸、奎尼酸、L-精氨基琥珀酸、3-甲基-3-丁烯基-芹糖(1→ 6) 葡萄糖苷、擬人參皂苷 F11 和番荔枝堿是差異成分，可能是導致療效變化的原因。

利用斑馬魚模型、網絡藥理學和Q-PCR 技術進一步分析表明，人參皂甙 Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙 Rg6、蘋果酸、奎尼酸和擬人參皂甙F11是抗心力衰竭的藥效學標志物（P標志物）。通過斑馬魚模型和代謝組學技術，研究人員快速鑒定了 AG 中抗心力衰竭的P標志物，這些P標志物可能為AG的質量控制和新藥開發提供新的參考標準。

文章題目

Identification of key pharmacodynamic markers of American ginseng against heart failure based on metabolomics and zebrafish model

雜志：Frontiers in Pharmacology

發表時間：2022年10月

作者：王松松，韓利文等

單位：山東第一醫科大學、山東省醫學科學院等

01、實驗設計

02、研究結果

1.  各地區西洋參樣品抗心力衰竭效果評價

表1列出了 AG 樣本及其收集時間，Q-PCR 檢測的引物序列見表 2。模型組斑馬魚心包面積、靜脈充血面積、SV-BA距離（靜脈竇和動脈球之間的距離）較對照組顯著增加（p < 0.01），說明鹽酸維拉帕米處理成功地誘導斑馬魚心力衰竭。我們用陽性藥物地高辛處理后，斑馬魚心臟的靜脈充血面積和SV-BA距離顯著逆轉（p <0.05）。與模型組相比，S6、S12 和 S14 治療組的斑馬魚心包面積顯著減少（圖 1C）。

然而，與模型組的斑馬魚相比，S8、S13 和 S15 治療組斑馬魚的心包面積沒有顯示出差異。治療后，與模型組相比，S6、S8、S10、S12、S14和S15治療組斑馬魚靜脈充血得到緩解（圖1D）。實驗結果表明，相較于模型組，所有 AG 樣本均顯著降低了各自組別斑馬魚心臟的 SV-BA 距離（除 S15 外）（圖 1E）。如圖 1F 所示，S13 對心力衰竭的改善率最低，S6 和 S10 的改善率較高。

表1 AG 樣本的采集信息

表2 Q-PCR 分析的引物序列

圖1 從不同地區收集的 AG 抗心力衰竭活性的比較。(A) 斑馬魚心力衰竭實驗藥物治療示意圖；(B) 斑馬魚心臟的表型顯微照片；(C) 斑馬魚心臟心包面積的統計結果。n = 10; (D) 斑馬魚心臟靜脈充血面積的統計結果。n = 10; (E) 各組斑馬魚心臟中SV-BA的統計結果。n = 10; (F)不同地區AG樣本心力衰竭改善率的比較。心力衰竭改善率=（A1+A2+A3）/3，A=（Φ-a）/Φ*100%，Φ：模型組平均值，（A）樣本組值；##p < 0.01 與對照組相比；*p < 0.05 和 **p < 0.01 與模型組相比。

2. 非靶向代謝組學篩選西洋參潛在活性成分

研究人員對原始數據進行預處理以獲得總離子色譜圖的疊加圖（圖 2A、B），使用保留時間的校準曲線可視化校準過程。此外，峰的保留時間應在可用標準中觀察到的保留時間的±0.2 分鐘保留時間窗口內。

如圖 2C、D 所示，AG 樣品的峰符合標準。經XCMSonline軟件預處理后，共得到4535個正離子模式p<0.01的色譜峰和2668個負離子模式色譜峰。

圖2 AG 樣品的總離子色譜圖疊加圖。(A) 正離子模式下校正的總離子色譜圖；(B) 負離子模式下校正的總離子色譜圖；(C) AG樣品在正離子模式下的保留時間偏差圖；(D) AG樣品在負離子模式下的保留時間偏差圖。

研究人員將12批AG的MS數據輸入OneMap進行主成分分析。如圖3A所示，PCA散點圖由正離子模式下的第一主成分（53.2%）和第二主成分（11.8%）構成。

他們觀察到從兩個區域獲得的AG樣品明顯分離，表明兩組的某些化合物不同。在負離子模式下，第一和第二主成分分別為 53.1% 和 15.3%（圖 3D）。AG樣品與散點圖沒有完全分離，因此需要進一步建模和分析。

圖3 AG代謝組學數據的多變量統計分析。(A) 正離子模式下的 PCA 散點圖；(B) 正離子模式下的 OPLA-DA 散點圖；(C) OPLA-DA 在正離子模式下的 S 圖；(D) 負離子模式下的 PCA 散點圖；(E) 負離子模式下的 OPLA-DA 散點圖；(F) OPLA-DA 在負離子模式下的 S 圖；(G) 人參皂苷 Rg6 的 MS2 光譜。

此外，在主成分分析之后，研究人員使用有監督的 OPLS-DA 進一步分析這兩組之間的差異。如圖 3B 所示，E OPLS-DA 分析可以顯著區分來自兩個區域的 AG 樣本。正負離子模型中R2Y(cum)和Q2(cum)的值分別為0.98、0.85、0.92和0.84，表明OPLS-DA模型具有良好的可測性和適用性。

置換檢驗驗證了 OPLS-DA 模型是否過擬合。PT 的結果是 R2 = (0.0, 0.21) 、 Q2 = (0.0, -0.51) 、 R2 = (0.0, 0.33) 和 Q2 = (0.0, -0.65)。Q2值與縱坐標的回歸線交點小于零，左側所有Q2值均小于右側最高值，說明了模型的可用性。 VIP 值 > 1.5，p < 0.05，并且 |pcorr| > 0.58 用于篩選可能重要的碎片離子（表 3）。結果使用 OPLA-DA 模型的 S 圖表示（圖 3C，F）。

通過標準物質或 MS/MS 數據確定了總共九種潛在重要成分對心力衰竭的保護作用（表 4）?；衔?是展示化合物結構識別過程的一個例子?；衔?測定了 m/z 767.4917[M + H]+ 的準分子離子；因此，研究人員推算出的分子式為C42H70O12，誤差為3.7 ppm，與人參皂苷Rg6的分子式一致。 

MS/MS顯示，與文獻數據相比，得到了明顯的m/z 605.4393、587.4288、569.4183、443.3870和425.3762碎片離子，推斷碎片離子為m/z 605.4393 [M + H-Rha]+；587.4288[M+H-Rha-OH]+；569.4183[M+H-Rha 2OH]+； 443.3870 [M + H-Rha/Glc]+和 425.3762 [M + H-Rha/Glc-OH]+。因此，化合物 3 被推測為人參皂甙 Rg6（圖 3G）。

表3 篩選AG的潛在活性成分對抗心力衰竭

表4 使用 UHPLC-QE-Orbitrap-MS 鑒定來自 AG 的不同活性成分

3. 斑馬魚模型對已鑒定生物活性化合物的生物活性評價

研究人員使用斑馬魚模型驗證代謝組學篩選的潛在差異成分。其中，人參皂甙Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙Rg6、蘋果酸、奎尼酸和擬人參皂甙F11可顯著改善鹽酸維拉帕米處理斑馬魚引起的心力衰竭。

人參皂甙Rg3、人參皂甙 Rg6、奎尼酸和擬人參皂甙F11可以改善斑馬魚心臟心包面積、靜脈充血面積和SV-BA距離的擴張。人參皂甙Rg5和蘋果酸僅改善斑馬魚心臟的靜脈充血。不同濃度的 L-精氨基琥珀酸并未改善斑馬魚的心力衰竭（圖 4）。

圖4 人參皂甙 Rg3、人參皂甙 Rg5、人參皂甙 Rg6、蘋果酸、L-精氨基琥珀酸、奎尼酸和擬人參皂甙 F11 的抗心力衰竭活性驗證。（A-G）斑馬魚心包區的統計結果。n = 10; （A'-G'）斑馬魚心臟靜脈充血面積統計結果。n = 10; (A”-G”) 斑馬魚心臟SV-BA距離的統計結果。n = 10。##p < 0.01 對比對照組，*p < 0.05 和 **p < 0.01 對比模型組。

4. 生物活性化合物作用機制的網絡預測

人參皂甙Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙Rg6、蘋果酸、奎尼酸和擬人參皂甙F11的靶點和調控途徑如圖5A-5F所示。結果表明，這六種化合物可分別靶向α7煙堿型乙酰膽堿受體（CHRNA7）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARA）、Bcl-2樣蛋白1（BCL2L1）、肝細胞生長因子受體（MET）、成纖維細胞生長因子 1 (FGF1) 以及參與多種信號通路的信號轉導和轉錄激活因子 3 (STAT3)。

此外，結果表明分子對接中的結合能很高。蘋果酸靶向兩個靶點，即法尼基二磷酸法尼基轉移酶 1 (FDFT1) 和 CHRNA7。奎尼酸靶向兩個途徑和七個靶點，包括 PPARA、脂肪酸結合蛋白 2 (FABP2) 和 FABP3。

在網絡預測分析中，人參皂苷Rg3靶向BCL2L1，這是信號通路中的關鍵靶點。 MET 編碼肝細胞生長因子 (HGF) 的受體酪氨酸激酶 c-MET，這是人參皂甙 Rg5 對抗心力衰竭的重要靶點。人參皂甙Rg6靶向6個靶點和4條通路，正如擬人參皂甙 F11 所執行的那樣。

圖5 抗心力衰竭和分子對接二維圖的 C-T-P 網絡。（A-F）人參皂苷 Rg3、奎尼酸、人參皂苷 Rg6、擬人參皂苷 F11、蘋果酸和人參皂苷 Rg5 的 C-T-P 網絡；(A'-F') 生物活性分子的分子對接二維圖；(A”-F”) 正分子的分子對接二維圖。

預測靶點及相關分子對接信息見表5，顯示了六種藥效化合物的作用模式及其對應的對接靶點（圖5A'~5F'和5A“~5F”）。

蘋果酸的結合能（-4.117 kcal/mol）低于附著在受體上的陽性對照分子。羧基與 Val99 和 GLN103活性部位中的兩個氨基酸殘基形成氫鍵?？崴崤c PPARA 靶標的結合能為 -7.835 kcal/mol。雖然奎尼酸的結合能低于與受體結合的分子的結合能，但奎尼酸的結合能很高，因為在ASN219 和 LEU331活性部位中，它涉及羥基和兩個氨基酸殘基之間形成三個氫鍵。人參皂苷Rg3的結合能與附著在受體上的陽性對照分子的結合能略有不同。碳 20 的羥基和人參皂苷 Rg3 的糖苷部分與活性部位的三個氨基酸殘基（TYR108、ARG146 和 GLN118）形成三個氫鍵。

人參皂甙 Rg5 在活性部位中的四個氨基酸殘基（ASP1164、GLU1082、LYS1161 和 TYR1159）與極性糖苷部分的葡萄糖環結構上的羥基之間形成五個氫鍵。人參皂苷Rg6的結合能為-5.438 kcal/mol，高于受體FGF1配體。人參皂苷Rg6主要在活性不問中的兩個氨基酸殘基（GLY4126和LYS4113）與極性部分糖苷上的羥基之間形成三個氫鍵。擬人參皂苷 F11 與氨基酸殘基形成兩個氫鍵。

表5 對接蛋白的化合物信息

5. 西洋參關鍵化合物抗心力衰竭相關基因表達

為了闡明關鍵活性化合物對斑馬魚心力衰竭的改善作用的機制，我們通過 Q-PCR 分析確定了參與調節心力衰竭的基因的 mRNA 水平（圖 6）。

與對照組相比，維拉帕米處理組FGF2、VEGFA和STAT3的mRNA水平顯著升高（p < 0.01）。模型組FGF1、PPRA、CHRNA7 mRNA表達較對照組有中度升高。用人參皂甙 Rg3 處理可抑制 FGF1 和 STAT3 的 mRNA 表達水平（p < 0.05）。

與維拉帕米處理的斑馬魚相比，人參皂苷Rg5處理顯著降低了FGF2的mRNA表達水平（p < 0.05），而VEGFA的mRNA表達水平與模型組相比無統計學意義。人參皂甙Rg6處理明顯減弱模型組FGF2和VEGFA的mRNA表達水平（p < 0.05）。人參皂苷F11處理組FGF1、VEGFA、FGF2的mRNA表達水平顯著低于模型組（p < 0.05）?？崴岷吞O果酸對 PPARA 和 CHRNA7 的 mRNA 表達沒有顯著影響，但這兩種成分分別降低了 PPARA 和 CHRNA7 的 mRNA 表達水平。

圖6 潛在活性化合物對心力衰竭相關基因表達的影響。（A-F）用人參皂苷 Rg3、奎尼酸、蘋果酸、人參皂苷 Rg6、人參皂苷 Rg5 和擬人參皂苷 F11 處理的斑馬魚基因表達結果，##p < 0.01 與對照組相比，*p < 0.05 和 **與模型組相比，p < 0.01。

05、編者點評

據報道，西洋參作為一種補氣的中藥，對心臟有保護作用。因此，研究人員建立了斑馬魚心力衰竭模型作為評估本研究中 AG 主要活動的工具。作為介于細胞和哺乳動物之間的新型脊椎動物模式生物，斑馬魚近年來被廣泛應用于心臟保護藥物的篩選。本研究采用鈣離子阻滯劑鹽酸維拉帕米對斑馬魚進行處理，建立了心力衰竭藥物快速篩選模型。AG廣泛分布于北緯37°附近的低山地區，如北美五大湖區、中國東北、華北地區。中國目前有四個產區：東北、陜西、北京和山東。研究表明，AG的生長受氣候、溫度、水、土壤等環境因素的影響。我們的研究發現，由于生長環境不同，AG在這四個產區的抗心力衰竭活性存在差異。

各種案例研究報告稱，AG 中的許多成分對心臟具有保護作用。目前，已鑒定的人參皂苷是人參屬植物的主要次生代謝產物。人參皂甙 Re 可改善異丙腎上腺素誘導的大鼠心力衰竭。人參皂甙 Rh2 可改善 1 型糖尿病大鼠的心臟纖維化。人參皂甙 Rb1 通過抑制線粒體復合物 I 的 ROS 產生來減輕心肌缺血/再灌注損傷。本研究篩選人參皂甙Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙Rg6、蘋果酸、奎尼酸和擬人參皂甙F11作為AG的P標志物。值得注意的是，人參皂甙 Rg6、擬人參皂甙 F11 和奎尼酸的抗心力衰竭活性首次被報道。

藥效標志物（P-marker）是在中藥質量標志物（Q-marker）的基礎上提出的一個新概念。P標志物是中藥發揮部分或全部藥效作用的關鍵成分。P標志物和Q標志物的區別在于后者是反映中藥質量的標志物，而前者側重于與生物活性直接相關的標志物。本研究綜合了斑馬魚模型和代謝組學的優勢，建立了“組分-活性”一體化研究策略的新模式，可以快速發現與特定活性相關的標志物。這一策略在我們之前的研究中已經應用于梔子藥效成分的研究。

網絡藥理學是一門集藥理學、生物信息學、物理化學為一體的新興學科。網絡藥理學的出現為中藥多成分、多靶點的研究提供了新的方法。網絡藥理學技術可以實現多成分靶點識別，對已知或新藥成分進行靶點預測。本研究發現的藥效成分與FGF1、FGF2、VEGFA、STAT3、BCL2L1等靶點高度相關，網絡藥理學預測為后續深入驗證提供依據。

斑馬魚的表型和基因表達結果可以部分揭示本研究中發現的P標記的潛在作用機制。 FGF1、FGF2和 VEGFA被認為是刺激內皮細胞增殖和促進血管生成的重要因素。此外，STAT3 的結構激活也可以促進血管生成。在目前的研究中，維拉帕米處理的斑馬魚中 FGF1、FGF2、VEGFA 和 STAT3 mRNA 表達的增加表明它們可能對啟動心臟損傷中的血管生成作出反應。人參皂甙Rg3、人參皂甙Rg5、人參皂甙Rg6和擬人參皂甙F11預保護后，斑馬魚的心臟損傷得到緩解，研究人員推測這些成分可能在心力衰竭早期就通過參與調節心臟血管生成和早期心臟自我修復來保護心臟。 PPRA是葡萄糖轉運的關鍵調節劑。

心力衰竭激活 PPARA 以調節脂肪酸代謝并為心肌細胞提供能量。經奎尼酸對斑馬魚進行預保護后，研究人員觀察到PPARA 的低 mRNA表達，表明心力衰竭期間 PPARA 的激活改善了心肌功能和能量學。實驗數據表明，奎尼酸對抗心力衰竭可能與調節脂肪酸代謝給心肌細胞提供能量有關。作為線粒體途徑中凋亡的關鍵調節因子，BCL2L1 是促進細胞存活的常見抗凋亡蛋白。 

MET是HGF 的酪氨酸激酶受體，主要激活促生存途徑，比如防止細胞凋亡。人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg5和擬人參皂苷F11處理后BCL2L1和MET的mRNA表達增加，表明這三種成分可能通過抑制細胞凋亡來保護心肌細胞免受損傷，從而改善心力衰竭。乙酰膽堿與巨噬細胞上表達的 CHRNA7 結合，將促炎物質極化為抗炎亞型。 STAT3 通過抑制促炎基因轉錄而發揮抗炎作用，啟動有效的修復機制。經蘋果酸、人參皂甙Rg3、擬人參皂甙F11預保護后，CHRNA7、STAT3 mRNA的表達降低，提示蘋果酸、人參皂甙Rg3、假人參皂甙F11的心臟保護作用可能與炎癥反應的激活有關。

總之，我們使用斑馬魚模型和代謝組學技術確定了 AG 中抗心力衰竭的六個關鍵 P 標志物。本研究為發現和鑒定中藥潛在活性成分提供了一種新策略，與傳統研究模式相比具有優勢。這些結果可能有助于評估 AG 的內部質量。

作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！