不知各位小伙伴在做熒光定量qPCR實驗的時候有沒有遇到過以下這些情況？
主峰左邊有雜峰，疑似引物二聚體
主峰右邊有雜峰，疑似非特異擴增
基因表達無差異
每當出現這些情況，就意味著可能要重新做實驗。為確保下一次實驗不出錯，了解其原因十分重要，可能是體系污染導致，也可能是擴增特異性不足導致。在這里小翌教大家從引物設計的角度提升擴增特異性！
在進行qPCR引物設計時，相信有不少小伙伴聽過類似“跨內含子設計”的要求，那么，要跨內含子設計是啥？為什么要跨內含子設計呢？
以人基因組來說，平均每個基因有8.8個外顯子和7.8個內含子，80%的外顯子長度小于200bp，少于10%的內含子長度在1100bp以上，不到0.01%的內含子長度小于20bp。
我們在進行一些熒光定量qPCR實驗之前，需要提取RNA和反轉錄合成cDNA，cDNA作為模板用于分析基因表達情況。故在DNA序列上設計引物需避開內含子序列區域，選用外顯子區域序列用于引物設計?？吹竭@，有小伙伴會有疑問，那為啥不叫“外顯子設計”或者“去內含子設計”呢，為啥要稱為“跨內含子設計”？
是的，引物還需要跨內含子，在設計引物時需要讓一端引物或者兩端引物跨越內含子，否則熒光定量qPCR的熔解曲線可能出現雙峰或者多峰。
在單個外顯子上進行上下游引物設計
在這種情況下，由于產物序列一致且大小一致，從熔解曲線上難以分辨，看上去都是單一的熔解峰，但是在進行數據分析時，往往會有一種感覺，就是基因表達無差異或者差異結果不穩定。
在兩個外顯子上進行上下游引物設計
在這種情況下，產物差距就比較大了，基因組DNA(gDNA)擴增產物較cDNA擴增產物更長，熔解溫度(Tm值)更大，在熔解曲線上表現出來則是主峰右側的雜峰。當然還有一種情況，當以gDNA為模板所需擴增的片段很長，難以擴增，最終產物相對單一，熔解曲線峰也是相對單一的。
建議的上下游引物設計方式
引物跨內含子設計后，對于引物序列本身還有什么要求呢？接下來小翌給大家分享引物設計原則~
qPCR引物設計原則
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參考項 |
標準參考 |
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產物長度 |
80-300bp |
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引物長度 |
17-25 base |
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GC含量 |
40-60%（45-55%為最佳） |
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Tm值 |
上游引物F和下游引物R的Tm值不能相差太大，最好不超過1℃。 |
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引物序列 |
A、T、C、G整體分布盡量均勻。避開T/C或A/G的連續結構。 |
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3末端序列 |
避免GC rich或AT rich。3端堿基最好為G或C，盡量避免末端堿基為T。 |
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互補序列 |
避開引物內部或兩條引物之間有3個堿基以上的互補序列。 兩條引物間的3末端避開有2個堿基以上的互補序列。 |
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特異性 |
使用BLAST檢索確認引物的特異性。 |
01
產物長度
首選的產物擴增長度為80-200bp，必要時可選擇加長。通常擴增效率隨著擴增產物長度增大而減小。但是不能太短，否則難以區分是引物二聚體還是擴增產物。
02
末端序列
引物末端最好是G或C，因為GC堿基之間是三個氫鍵連接，能夠保證引物和模板連接的穩定性。
03
互補序列
引物3端通常是DNA聚合酶延伸的起點，如果兩條引物在3端互補性過高，則更易形成引物二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
若引物自身的互補性高，則會發生自身退火，形成發夾結構，或者兩條一樣的引物形成二聚體，從而降低PCR的擴增效率和特異性。
聊完了原則上qPCR引物如何設計之后，接下來讓我們進入小伙伴們最為關注的實戰操作。在這里小翌給大家介紹三種方式設計qPCR引物！
Primer3Plus
網址鏈接：https://www.primer3plus.com
01
Load server settings 選擇qPCR，后上傳設計引物的序列或粘貼需要設計引物的序列。按照自己的引物設計需求，選擇使用排除的區域Excluded Regions、目的擴增區域Targets和包含區域Included Region。
02
點擊General Settings按照熒光定量qPCR引物設計原則進行相關參數設置，例如擴增產物長度Primer Size Ranges、引物長度Primer Size、Tm值Primer Tm、GC含量Primer GC%。完成相關參數設置后，點擊右上方綠色按鈕Pick Primers，即可獲得相關引物。
03
獲得相關引物序列后，到NCBI blast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行引物特異性驗證。
Primerbank
網址鏈接：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
它是哈佛大學的一個PCR引物數據庫，包含 306,800 多種引物，涵蓋大多數已知的人類和小鼠基因。通過 Real Time PCR 測試了與 27681 個小鼠基因相對應的 26855 對引物，然后對 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳和測序。根據瓊脂糖凝膠電泳結果，設計成功率為 82.6%（22187 對引物）。
01
首先在NCBI上找到目的基因的gene ID，例如，這里選用老鼠基因IL6的gene ID 16193。
02
Search by選擇 NCBI Gene ID，Species選擇Mouse，輸入16193，點擊Submit，即可獲得相關引物。
03
相關引物還有已驗證的可視化結果。
NCBI
網站鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov
01
打開NCBI，選擇“Gene”，輸入想要檢測的基因名稱，我們以人基因“ALAD”為例。
02
會出現很多搜索結果，我們選擇需要的種屬來源，即“human”，如果你知道Gene ID（每個基因有且只有一個特定的ID，類似于人的身份證），也可以根據Gene ID來選擇。這里我們選擇搜索結果中的第一個。
03
點開之后，會出現很長的頁面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”欄下的NM編號，不同的NM編號，代表不同的isoform。選擇想要檢測的那一個。
確定NM號點擊后，可以看到這個isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因長度3129bp，CDS代表編碼蛋白區域149-1141bp。
以及此基因的序列，如下圖所示。此序列就是設計引物時對應的模板。
04
了解完我們所需的isoform后，我們可以點擊右側的“Pick Primers”，就能直接進入Primer-BLAST的頁面進行引物設計了。
05
在彈出來的界面里粘貼模板序列或者輸入基因序列號。另外需要設置“上下游引物位置”和“擴增子長度”。最主要的設置就是這兩點了，另外還有“物種名稱”、“數據庫”等其他選項可以設置。
設置好之后，點擊頁面左下角的“Get Primers”。
多對引物，選擇合適的引物即可。
06
獲得相關引物序列后，到NCBI blast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)進行引物特異性驗證。
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