體內細胞命運轉化是一種潛在的再生療法，可以用于損傷和疾病治療。之前的研究認為通過異位表達或敲低特定因子，可以將星形膠質細胞轉化為功能性神經元。然而，通過嚴格的譜系追蹤實驗證明，先前認為是由星形膠質細胞轉化而來的神經元，實際上是由內源性神經元轉化而來。通過AAV介導NEUROD1和報告基因的共表達，可以有效地誘導報告基因標記的神經元，但這些神經元無法通過譜系追蹤追溯到星形膠質細胞。相反，逆行標記方法表明內源性神經元是這些表達AAV標記神經元的來源。這些結果強調了譜系追蹤策略在體內細胞命運轉化研究中的重要性。

德克薩斯大學西南醫學中心分子生物學系和哈蒙再生科學與醫學中心的研究者們，通過嚴格的譜系追蹤發現，之前研究報道認為的星形膠質細胞轉化為神經元（astrocyte-to-neuron，AtN）并非起源于常駐星形膠質細胞，而是來自AAV感染的內源性神經元。研究成果以“Revisiting astrocyte to neuron conversion with lineage tracing in vivo”為題，發表在Cell（IF：66.85）上。

研究結果

1. 通過AAV靶向腦星形膠質細胞

研究人員比較了幾種常用AAV血清型在星形膠質細胞中的特異性表達能力。研究結果顯示，注射后4天，大多數AAV病毒主要在GFAP陽性的星形膠質細胞中檢測到基因表達。然而，到了注射后14天，AAV8和AAV9在星形膠質細胞中的表達顯著下降，而在神經元中的表達增加。相比之下，AAV2和AAV5在星形膠質細胞中的特異性表達相對穩定。因此，在后續實驗中，選擇了AAV5作為較為理想的AAV血清型。

2. 通過NEUROD1進行高效的體內AtN轉化？

研究人員通過注射不同病毒到小鼠皮層進行實驗。結果顯示，注射ND1-mCh病毒后，17天時79.8%的細胞為神經元，與對照組相比明顯增加。然而，整體神經元和星形膠質細胞密度沒有顯著變化，此外，注射ND1-mCh病毒未觀察到細胞表達未成熟神經元標志物。這表明ND1-mCh能有效標記神經元，但不會引起神經元密度的整體增加或未成熟神經元的出現。

3. 反應性星形膠質細胞不是NEUROD1誘導的標記陽性神經元的起源。

體內重編程將反應性星形膠質細胞轉化為神經元的治療前景很有希望。通過在受傷的小鼠皮層進行實驗，研究人員成功地將活性星形膠質細胞轉化為神經元。然而，這種轉化的效率很低，并未觀察到顯著增加周圍神經元密度的現象。因此，反應性星形膠質細胞對NEUROD1誘導的神經元的形成沒有起到重要作用。

4. 譜系示蹤的星形膠質細胞不是NEUROD1誘導的標記陽性神經元的起源。

研究人員使用他莫昔芬誘導的小鼠模型追蹤星形膠質細胞的命運。通過注射不同病毒，他們發現轉化為神經元的細胞并非源自星形膠質細胞，而是可能來自其他細胞類型。這表明星形膠質細胞在體內重編程中的貢獻有限。

5. 腦損傷未能促使NEUROD1將被追蹤的星形膠質細胞轉化為神經元。

研究人員在經過他莫昔芬處理的小鼠中進行了腦損傷，并注射了mCherry或ND1-mCherry病毒。結果顯示，ND1-mCherry病毒能夠有效誘導mCherry+NeuN+細胞的產生，表明環境條件可能對星形膠質細胞的轉分化起調控作用。然而，只有很少一部分細胞同時表達mCherry、NeuN和YFP，這可能是由于遺傳標記背景的變異所致。

6. 基于AAV的Cre-FLEX系統未能限制星形膠質細胞中的基因表達。

研究人員使用基于AAV的Cre-FLEX系統進行Astrocyte-to-Neuron轉換實驗，但發現該系統在細胞類型特異性方面存在限制。雖然可以成功觀察到轉化后的神經元，但部分AAV血清型表達的Cre也在神經元中活躍，導致缺乏準確的細胞追蹤。因此，該系統需要改進以實現更好的細胞類型特異性。

7. 限制于星形膠質細胞的NEUROD1無法引起AtN轉換。

研究者使用了限制NEUROD1在星形膠質細胞中表達的策略，并注射了F-mCh或F-ND1-mCh AAV5病毒。結果表明，僅在成年星形膠質細胞中限制NEUROD1表達時，無法迅速誘導神經元形成。進一步的實驗表明，即使在腦損傷后，仍無法通過星形膠質細胞特異性的NEUROD1誘導實現星形膠質細胞向神經元的轉化。

8. 他莫昔芬和遺傳背景都不會影響NEUROD1誘導報告基因陽性神經元的能力。

他莫昔芬處理對NEUROD1重編程能力的抑制不太可能發生，因為實驗證據顯示，無論是在他莫昔芬處理前注射病毒還是延遲處理方案中，NEUROD1仍然能夠成功誘導mCherry+神經元的形成，而且沒有受到YFP追蹤的影響。因此，他莫昔芬處理不會阻斷NEUROD1的重編程能力。

9. NEUROD1誘導的標記陽性神經元是內源性神經元。

遺傳譜系追蹤和BrdU標記結果表明，駐留的星形膠質細胞不是NEUROD1誘導的mCherry+神經元的來源。相反，通過逆行標記方法，研究人員發現內源性神經元是NEUROD1誘導的mCherry+神經元的來源。這些結果表明NEUROD1不能將星形膠質細胞直接轉化為神經元，而是依賴于內源性神經元作為轉化的來源。

10. 標記陽性神經元可以由選擇性AAV表達因素誘導。

研究發現，使用hGFAP啟動子下的AAV5病毒可以改變細胞類型特異性。通過檢查多個因素的影響，發現PAX6、MYC、ASCL1和NEUROG2能夠選擇性地誘導mCherry+神經元，而SOX2、OCT4、KLF4和BDNF沒有相同的效果。這表明hGFAP啟動子下的AAV5病毒的細胞類型特異性可以被下游因素選擇性地改變。

11. 啟動子特異性可能由NEUROD1調節。

NEUROD1可能通過調節hGFAP啟動子的特異性來誘導內源性神經元中的報告基因表達。共注射hGFAP-GFP AAV5病毒和mCh或ND1-mCh AAV5病毒的實驗顯示，在ND1-mCh組中觀察到了許多特異性的mCherry+神經元，但很少觀察到GFP+神經元。這暗示NEUROD1可能在內部調控hGFAP啟動子的特異性。進一步的研究表明，與對照mCh AAV5病毒相比，共同包裝的AAV-hGFAP-ND1-mCherry病毒在感染神經元方面更有效，這進一步支持了NEUROD1可能調節病毒包裝過程中的特異性表達。這些結果表明NEUROD1可能以順式調節的方式影響hGFAP啟動子在內源性神經元中的表達特異性。

12. 誘導標記陽性神經元不需要NEUROD1的神經源性活動。

研究人員通過制作NEUROD1突變體來進一步研究其分子機制。實驗結果表明，NEUROD1突變體失去了神經源性活性，但仍能有效誘導mCherry+神經元的產生。這表明NEUROD1誘導神經元的能力與其神經源性活性無關。

13. AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1既不能有效地下調PTBP1，也不能在體內轉換紋狀體星形細胞。

研究人員調查了PTBP1對星形膠質細胞轉化為神經元的作用。他們使用CRISPR-CasRx系統，將AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1病毒注射到小鼠紋狀體中，并進行了譜系追蹤實驗。結果顯示，在CasRx-Ptbp1組中，只有22.7%的mCherry+細胞表達了神經元標記物NeuN，但沒有被YFP標記，暗示它們不是星形細胞的后代。此外，通過免疫染色和免疫印跡驗證，研究人員發現CasRx-Ptbp1病毒對PTBP1的表達僅有輕微下降。綜上所述，AAV-GFAP-CasRx-Ptbp1病毒既未成功降低PTBP1的表達，也未能將紋狀體星形膠質細胞轉化為神經元，與之前的報道相矛盾。

14. PTBP1敲除未能在體內轉換紋狀體星形膠質細胞。

基于shRNA的方法進一步證實，沉默Ptbp1并不能將星形膠質細胞轉化為神經元。無論是使用CRISPR-CasRx系統還是shRNA靶向Ptbp1，結果都顯示僅有少數mCherry+細胞表達神經元標記物NeuN，而這些細胞并非星形膠質細胞的后代。因此，研究結果與之前的報道存在明顯差異，表明Ptbp1的下調對于將星形膠質細胞轉化為紋狀體神經元并不有效。

進一步的實驗使用了AAV-CMV-LSL-RFP和AAV-CMV-LSL-RFP-shPtbp1載體，將其注射到年輕的mGfap-Cre;R26R-YFP小鼠的紋狀體中。研究結果表明，盡管成功敲除PTBP1，常駐紋狀體星形膠質細胞無法在體內轉化為神經元，無論是通過CRISPR-CasRx系統還是基于shRNA的方法。無論使用何種方法，都沒有觀察到常駐星形膠質細胞向神經元的轉化，這與之前的報道形成了鮮明對比。

研究總結

這篇文章通過遺傳譜系追蹤和逆行標記的方法，重新審視了星形膠質細胞向神經元的轉化過程。結果表明，星形膠質細胞并不是NEUROD1誘導的神經元的主要細胞來源。進一步實驗證明，這些NEUROD1誘導的神經元實際上是來源于內源性神經元。研究還發現，NEUROD1可以選擇性地改變hGFAP啟動子的細胞特異性，但不能廣泛上調該啟動子的表達。此外，通過PTBP1基因的沉默實驗也未觀察到星形膠質細胞向神經元的轉化?？傮w而言，這些結果揭示了星形膠質細胞向神經元的轉化過程的細節，并為深入理解神經元發生和修復提供了重要線索。