上期我們已經對AAV在免疫細胞中的靶向策略從注射方式的角度進行了討論。免疫細胞的種類繁多，因為免疫細胞本身的特性它的感染效率不高，針對免疫細胞的特異性的啟動子種類也比較少。隨著細胞和基因治療的火熱進行，有越來越多的針對靶向免疫細胞的AAV進行了研究，接下來小編將分成幾期進行相關的實例分析。這一期我們一起來看看針對巨噬細胞做的相關研究。
Engineering monocyte/macrophage?specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing[1]
高雪氏?。℅D）是由GBA基因突變引起的遺傳學疾病，它導致葡萄糖腦苷酯酶（GCase）缺乏，從而導致高糖脂降解負擔造成很多細胞累積糖脂，尤其是巨噬細胞。主要有三種臨床類型：GD1、GD2和GD3。GD1是最常見的表型，通常表現為肝脾腫大、骨疾病以及細胞減少還有不同程度的肺部疾病。目前治療GD1的方法包括口服葡糖苷酸合成酶的小分子抑制劑（SRT）和葡萄糖腦苷脂酶替代物（ERT）靶向巨噬細胞通過甘露糖介導的攝取。除此之外，異體造血干細胞移植已經成功用于GD的一次性治療。它的治療效果是通過提供移植的GCase組分的巨噬細胞。這表明僅恢復巨噬細胞的GC酶功能就可以糾正GD1的表型。因此，在病人自己的造血系統中恢復GC酶的活性建立一種自體的方法，就可以避免異體造血干細胞的許多風險。
由于這些原因，研究人員通過把非靶向的基因添加到人類造血干細胞和祖細胞中進行探索：首先使用的是逆轉錄病毒后來使用慢病毒載體，在小鼠的GD模型中取得了很好的結果。由于插入性突變和惡性轉化的發生，需要開發針對性的基因添加策略，以產生人類治療的轉基因HSPCs。現代基因組編輯工具可以實現單堿基對精度的基因修飾和整合。細菌CRISPR/Cas9系統衍生出的一個高度可工程化的平臺已被優化用于基因編輯。Cas9會刺激兩種修復途徑的一種：(1) 非同源末端連接（NHEJ）以及(2)同源定向修復（HDR）。
在人類HSPCs中，AAV6基因組是一種有效的同源修復方法。HDR途徑不僅可以利用來實現單堿基對的變化，而且還可以將整個表達盒整合到非必要的安全港位點，從而實現調控區、轉基因和可選擇標記的可調整組合的穩定表達。一個潛在的安全港基因座是CCR5。這篇文獻中，研究人員利用RNP（sgRNA和Cas9核糖核蛋白復合物）/AAV6平臺，實現了GCase盒能有效的整合到CCR5安全位點。并且利用一個在單核細胞/巨噬細胞中高度表達的系譜特異性啟動子的啟動子，研究人員實現了GCase在受影響的細胞系中的表達，同時也盡量減少在造血干細胞和祖細胞中的異位表達。
如下圖所示，研究人員為了驗證CD68S啟動子的系別特異性，將CD68S-GCase-Citrine+和SFFV-GCase-Citrine+與HSPCs一起培養。SFFV-GCase-Citrine+細胞的比例在HSPC和巨噬細胞中都保持穩定。相反，CD68S-GCase-Citrine+細胞的百分比在HSPC培養物中減少，但在巨噬細胞培養物中保持不變。由CD68SGCase-Citrine+和SFFV-GCase-Citrine+HSPCs衍生的巨噬細胞表達的GCase比巨噬細胞高2-3倍。
病毒產品 | AAV6-CD68S |
實驗動物 | NSG小鼠 |
注射方式 | 體外感染細胞,回輸小鼠 |
注射量 | MOI=1*104~2*104 |
STING Induces Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Promoting Calcium-Dependent Caspase 1-GSDMD Processing in Macrophages[2]
主要內容：
巨噬細胞中干擾素基因刺激因子（STING）對肝臟缺血再灌注損傷（IRI）有重要的調節作用，但是STING依賴性的先天免疫的基本機制激活肝臟巨噬細胞（Kupffer）的機制仍然不清楚。這篇文獻研究了STING對肝臟巨噬細胞的熱化作用以及肝臟IRI的相關調節機制。使用了磷酸脂質體來阻斷肝臟的巨噬細胞，然后使用AAV-STING-RNAi-F4/80-EGFP轉染到小鼠的門靜脈中，在14天之后建立了肝臟的IRI模型。體外實驗使用了STING特異性的siRNA處理肝臟的巨噬細胞，建立了缺氧-復氧（H/R）模型。結果表明，STING的表達隨著肝臟IRI的增加而增加，但是在磷酸脂質體阻斷肝臟巨噬細胞之后，STING的表達量明顯下降。敲除STING后，巨噬細胞中的Caspase 1-GSDMD的激活和肝臟IRI得到了緩解。更有趣的是，缺氧/復氧（H/R）增加了肝臟巨噬細胞中的鈣離子濃度，但STING敲除后，鈣離子濃度卻下降。BAPTA-AM抑制肝臟巨噬細胞的鈣離子后，巨噬細胞的熱化現象明顯減少，但STING的表達卻沒有明顯減少。這些結果表明敲除STING可以減少鈣依賴性的巨噬細胞caspase 1-GSDMD介導的肝臟IRI，是一種潛在的治療方法。
在本文中，研究人員證實敲除巨噬細胞中的STING可減輕肝臟IRI。在肝臟IRI建模前14天，用AAV-STING-RNAi-F4/80-EGFP預處理（靜脈注射）小鼠，對照組病毒為AAV-Ctrl-F4/80-EGFP。從各組肝臟中分離出KCs，然后用WB以及免疫組化檢測各組KCs中STING的表達。
病毒產品 | AAV6-F4/80 |
實驗動物 | C57BL/6N野生型小鼠（8-10周） |
注射方式 | 門靜脈（肝巨噬細胞Kupffer） |
注射量 | 1 × 1011vg |
Mannose receptor modulates macrophage polarization and allergic inflammation through miR-511-3p[3]
主要內容：
甘露糖受體（MRC1/CD206）被認為是通過多種糖類過敏原介導過敏性吸食和哮*。研究人員證明了一種保護機制，在該機制中MRC1通過其內含的miR-511-3p限制過敏性炎癥。作者利用野生型C57和MRC1介導的肺巨噬細胞對過敏原的攝取和肺部炎癥進行了研究。在巨噬細胞的極化和過敏原的誘導中miR-511-3p的作用是在轉染了(AAV)–miR-511-3p的小鼠中誘導肺部的炎癥。
如下圖：研究人員通過一個表達miR-511-3p的AAV載體（AAV-CMV-EG）感染小鼠，通過流式去檢測BAL和肺部巨噬細胞的表達，通過免疫熒光進行染色也進行了驗證。之后用這些被AAV感染的小鼠用于小鼠哮*模型的建立。結果表明被AAV-miR-511-3p感染的小鼠大大抑制了由造模引起的支氣管周圍炎癥和絨毛膜細胞增生。
病毒產品 | AAV9-CMV |
實驗動物 | C57BL/6N野生型小鼠（6-8周） |
注射方式 | 氣管內注射（肺巨噬） |
注射量 | 5x1010 pfu~1 × 1011vg |
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1.Scharenberg, S.G., et al., Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nat Commun, 2020. 11(1): p. 3327.
2.Wu, X.Y., et al., STING Induces Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Promoting Calcium-Dependent Caspase 1-GSDMD Processing in Macrophages. Oxid Med Cell Longev, 2022. 2022: p. 8123157.
3.Zhou, Y., et al., Mannose receptor modulates macrophage polarization and allergic inflammation through miR-511-3p. J Allergy Clin Immunol, 2018. 141(1): p. 350-364 e8.