簡單思路也可以發20分文章！一起看看怎么做？
目前，不管是不是在醫學界，只要關心生命科學領域的同學，應該都知道PD-1/PD-L1、PD-1/PD-L1抗體是目前腫瘤免疫治療的大熱門，與PD-1/PD-L1相關的文章通常都能加分不少。
迄今為止，PD-1/PD-L1抗體獲得批準的適應癥包括晚期黑色素瘤、頭頸鱗癌、非小細胞肺癌、尿路上皮癌、霍奇金淋巴瘤、默克爾細胞癌(Merkel's cell carcinoma)和微衛星不穩定（MSI-H）實體瘤，在腫瘤治療上具有廣譜性。除腫瘤外，PD-1/PD-L1在其他疾病中也被大力研究。目前一款PD-L1抗體也已獲批進入慢性乙肝的臨床試驗。但尷尬的是，只有不到40%的癌癥患者會對PD-1/PD-L1阻斷產生響應，而且不斷有報道發現患者對腫瘤免疫治療產生耐受，目前臨床上針對PD-1/PD-L1抑制劑的應用也多采用聯合應用的策略。
因此如何進一步提高PD-1/PD-L1抗體的療效，如何進行聯合用藥是臨床上亟待解決的難題。臨床上的問題就是我們開展臨床基礎科研的基礎，所以很多研究圍繞PD-1/PD-L1的分子調控機制開展，這也是近年來國自然的研究熱點。那么具體如何開展相關研究呢？今天小G博士就給各位分享一篇和PD-L1相關的腫瘤研究高分文章，思路也是與我們一直介紹的A基因調控B機制影響C疾病的D功能類似，簡單、易懂，還好上手。
ADORA1敲減在細胞以及
動物水平的抗腫瘤作用
首先，作者找了基因ADORA1，發現在黑色素瘤細胞上敲減ADORA1或者使用ADORA1抑制劑DPCPX(DX)可顯著抑制細胞的增殖，并且抑制AKT以及MAPK通路。ADORA1敲減也顯著抑制了裸鼠皮下瘤體的生長，延長荷瘤小鼠的生存時間。以上結果均說明ADORA1的敲減可以抑制腫瘤細胞的生長。
而ADORA1是腺苷酸A1受體，研究報道發現腺苷酸會在腫瘤微環境中累積，并通過腺苷酸受體激活下游通路影響細胞的免疫內環境穩態，那么ADORA1是否可能會影響到腫瘤免疫系統？作者首先在免疫健全小鼠C57BL/6上進行皮下成瘤試驗，結果卻出人意料，ADORA1敲減組與對照組之間的瘤體以及動物生存期竟無顯著差異。進一步對瘤體進行分析，發現ADORA1敲減組瘤體內浸潤的CD8+T細胞較對照組顯著減少，而PD-1+和TIM3+陽性的耗竭性CD8+T顯著增加。這一結果說明，雖然ADORA1敲減可顯著抑制腫瘤細胞本身的增殖，但同時也會促進腫瘤細胞的免疫逃逸，所以在免疫健全小鼠體內ADORA1敲減沒有表現出腫瘤抑制作用。
ADORA1敲減促進腫瘤免疫抑制
PD-1/PD-L1通路是免疫抑制通路中目前研究最多的通路，所以緊接著，作者對免疫健全小鼠的瘤體進行免疫熒光和PCR檢測，發現ADORA1敲減組小鼠的瘤體內PD-L1的蛋白和mRNA水平顯著上升，在細胞系上運用ADORA1敲減、敲除以及抑制劑進行驗證的結果也一致。在功能上，ADORA1敲減也使腫瘤細胞對T細胞介導的細胞殺傷更耐受。
以上結果說明ADORA1敲減在抑制腫瘤細胞增殖的同時，還會促進細胞PD-L1的表達，增強腫瘤細胞的腫瘤免疫逃逸，這看似矛盾的結果，其實為PD-L1的聯合應用提供有力的基礎證據。
ADORA1敲減/抑制劑與PD-1抗體聯合應用抗腫瘤
作者接著在免疫健全鼠上進行ADORA1敲減細胞的皮下成瘤試驗，并同時給予PD-1抗體，結果發現ADORA1敲減或者DX和PD-1抗體的聯合應用，與單獨ADORA1抑制或者PD-1抗體相比，可顯著抑制瘤體的生長，并延長荷瘤鼠的生存期，瘤體內的CD8+T細胞數量也顯著增加。如果同時運用CD8α抗體，則會抑制ADORA1抑制劑和PD-1抗體聯用的腫瘤抑制效果。這些結果說明抑制ADORA1可通過調控PD-L1促進腫瘤免疫抑制，而如果將ADORA1抑制劑與PD-1抗體聯用可顯著促進PD-1抗體的治療效果，證明了ADORA1是一個具有重要臨床意義的治療靶點。
ADORA1調控PD-L1的分子機制
在細胞和動物水平的實驗說明了ADORA1的功能，接下來就要研究ADORA1調控PD-L1的分子機制了。為了探討ADORA1的下游分子機制，作者首先采用了RNA-seq來篩選下游差異基因，ATF3是ADORA1敲減后表達差異最大的轉錄調控因子，而且ATF3和PD-L1在腫瘤公共數據庫中具有表達相關性，同時ADORA1敲減在促進PD-L1表達的同時，也會促進ATF3的表達。更進一步的研究發現，ATF3的敲減或敲除都會導致PD-L1表達的下調，反之ATF3的過表達會促進PD-L1的表達。
通過分子表達相關性實驗驗證了ADORA1和ATF3以及PD-L1的表達相關性，接著作者運用luciferase實驗以及ChIP實驗證明了ATF3可與PD-L1基因的啟動子區結合，并調控PD-L1基因的轉錄。
在動物模型上，ATF3的敲減與DX（ADORA1抑制劑）聯用可顯著促進免疫健全小鼠黑色素瘤和肺癌模型上DX介導的抗腫瘤作用，延長荷瘤鼠的生存期，對瘤體的分析發現，ATF3敲減同樣抑制了DX引起的PD-L1表達上調作用，促進了CD8+T細胞的浸潤。
ADORA1-ATF3-PD-L1的臨床相關性分析
最后回到臨床，在肺癌臨床樣本上，ADORA1的表達與PD-L1水平負相關，而ATF3與PD-L1表達正相關。
同時，作者分析了19例接受PD-1抗體治療的肺癌患者，其中11例對PD-1抗體治療有較好的響應，而另外8例無響應。在19例中有15例患者組織ADORA1與PD-L1表達負相關，而ATF3與PD-L1表達正相關。在患者案例分析中發現，1號患者低表達ADORA1，PD-1抗體治療后瘤體顯著縮小，而12號患者高表達ADORA1，在PD-1抗體治療后瘤體反而增大。分析所有患者的ADORA1表達和腫瘤直徑的變化，發現ADORA1表達越高，瘤體直徑越大。
最后，作者分別分析了ADORA1-ATF3-PD-L1與肺癌患的預后相關性，說明了ADORA1和ATF3的臨床意義。
這篇文章的思路其實比較清晰明了。
首先通過細胞和動物實驗說明了ADORA1敲減的腫瘤增殖抑制和促腫瘤免疫抑制這雙重功能，在動物模型上運用基因敲減或者抑制劑與PD-1抗體聯用較單一處理方式有更強的抗腫瘤作用，說明ADORA1抑制的臨床應用價值。
在機制上通過RNA-seq篩選到下游分子ATF3，luciferase和ChIP驗證ATF3與PD-L1基因啟動子的結合，并且ATF3敲減與ADORA1抑制劑聯用也可顯著抑制腫瘤生長。
最后回到臨床樣本上，再次證明ADORA1-ATF3-PD-L1的臨床相關性。
整篇文章的亮點就在于ADORA1對PD-L1的調控以及ADORA1抑制與PD-L1抗體的聯合應用，為PD-1抗體的臨床應用提供又一新的思路和研究基礎，這樣一篇與免疫治療熱點密切相關，且具有重要臨床意義的文章，雖然思路簡單，但是就能發表20分的文章。更多的與免疫抑制調控相關的基因值得大家去挖掘發現，下一個高分文章等著您！
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