鑒于單獨的基因組信息的有限性，上海中醫藥大學附屬龍華醫院、上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所陳文連團隊聯合江蘇省南通市腫瘤醫院王偉團隊以及香港浸會大學賈偉團隊等多個科研單位合作從多組學（轉錄組+蛋白質組+磷酸化蛋白質組+代謝組）層面上揭示了食管鱗狀細胞癌的分子特征及潛在治療靶點。研究成果以“A multi-omics study delineates new molecular features and therapeutic targets for esophageal squamous cell carcinoma”為題，發表在Clinical and Translational Medicine（IF：8.554）上。
多組學樣本分組設置及臨床特征
1.?人轉錄組RNA測序+DIA蛋白質組+磷酸化蛋白質組+代謝組：
食管鱗狀細胞癌癌組織（ESCC）：n=24
食管鱗狀細胞癌正常癌旁組織（NAT）：n=24
注：由于組織樣本量有限，僅有三對樣本進行了磷酸化蛋白質組學檢測。
2.?人食管鱗狀細胞癌患者的臨床特征：
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DIA蛋白質組共檢測了6507個蛋白，保留在超過50%樣本中有定量值的共計5511個蛋白進入下游分析。磷酸化蛋白質組共檢測到來自3215個蛋白上的共11232個磷酸化位點，保留無定量缺失值的來自2740個蛋白的7186個磷酸化位點進入下游分析。代謝組保留在超過50%樣本中有定量值的共計200個代謝物進入下游分析。
1.?食管鱗狀細胞癌（ESCC）的多組學分子景觀
（1）與已有的轉錄組RNA測序數據比較
在已經報道的53對ESCC癌和癌旁組織的轉錄組RNA測序結果中，癌 vs 癌旁共有116個上調基因和43個下調基因。其中，116個上調基因中的76個（65.52%）、43個下調基因中的32個（74.41%）在本研究的RNA測序結果中出現了一致的變化趨勢。這表明本結果與已報道結果的一致性。
（2）ESCC癌組織和癌旁組織在多組學層面上有明顯的差異
研究者隨后分別從轉錄組（基因mRNA表達和mRNA異構體（isoform）層面）、蛋白質組、磷酸化蛋白質組和代謝組層面對所有樣本分別進行非監督的表達量聚類分析及整合多組學聚類。結果表明，在各種組學層面及整合多組學層面上，ESCC癌組織和癌旁組織都有明顯的差異。最后，研究者是用DIABLO算法計算了個各組學間的相關性。結果顯示，任意兩個組學間都有高的相關性，這表明ESCC組織和癌旁組織之間的差異性在各個組學層面上是一致的。
正常小鼠和食管癌小鼠的食管組織轉錄組RNA測序和代謝組學結果分析也顯示出顯著的差異。這表明，ESCC癌組織和正常組織間的差異性在物種間的保守性。
2.?轉錄組和蛋白質組的不一致性表明了廣泛的轉錄后和翻譯后調控
基因的表達經歷轉錄成mRNA和mRNA翻譯為蛋白的兩個主要過程。研究者比較了在轉錄組和蛋白質組層面上的相關性（共6174個mRNA-蛋白質對）。結果表明，癌組織和癌旁組織的mRNA和蛋白質之間的相關性很低。在癌和癌旁組織中，基因層面上的mRNA的蛋白質相關性中位值分別為0.06和0，而樣本層面上的mRNA和蛋白質相關性中位值分別為0.20和0.15。該結果意味著在組織中存在著廣泛的轉錄后和翻譯后調控。
研究者繼續比較了癌 vs 癌旁組織mRNA變化倍數從下調到上調的順序增長過程中，相應蛋白質的表達變化情況。總體來看，在癌組織中有更多的表達上調的蛋白質，且不管是mRNA變化下調、不變和上調，都有相應的蛋白質發生上調變化。同樣地，癌組織中也有更多的上調mRNA。這些結果表明，癌組織的mRNA轉錄和翻譯增強，且有更活躍的轉錄后調控。
研究者假設在mRNA和蛋白水平均上調的基因（定義為高轉錄和高翻譯活性的基因）是導致可以觀測到的癌和癌旁組織間的差異的核心上游信號。于是對這部分共480個基因進行了GO功能富集分析，顯示了RNA加工、RNA剪接和基因表達的活性在ESCC組織中的顯著增強。這些基因中包括了在癌組織中蛋白表達量非常高的富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子10（SRSF10）、剪接因子3A亞基2（SF3A2）、切割活化因子2（CSTF2）和復制時間調節因子1（RIF1）。在ESCC癌組織蛋白質組結果中SRSF10、SF3A2,和CSTF2表達量與增殖標志物 Ki-67和/或PCNA正相關。此外，SRSF10 和SF3A2與分化標志物S100A14負相關。這些結果表明，SRSF10、SF3A2和CSTF2 可能較活躍地參與了ESCC的惡性進展。
3.?整合分析ESCC的分子通路和代謝特征
因為mRNA和蛋白的高度不一致，研究者使用蛋白質組、磷酸化蛋白質組和代謝組進一步分析人ESCC中的分子改變。
（1）蛋白質組：癌 vs 癌旁共得到2890個差異蛋白。差異蛋白的KEGG通路富集分析顯示ESCC腫瘤中有更高水平的剪接體、組蛋白和核糖體相關蛋白，以及低水平的細胞骨架蛋白。研究者繼續使用GSVA對差異蛋白的活性進行量化，在ESCC中共發現了157個顯著變化的通路，包括與RNA轉錄/加工/代謝、DNA合成和修復、蛋白合成、蛋白水解和細胞周期相關的通路。而與細胞連接、細胞間相互作用相關的通路則減弱。
（2）磷酸化蛋白質組：癌 vs癌旁共得到517個差異磷酸化位點。研究者對這些差異磷酸化位點的歸屬蛋白進行GSVA分析，結果顯示在ESCC腫瘤中存在著參與RNA轉錄、加工和代謝的通路的激活。
（3）代謝組：癌 vs癌旁共從200個代謝物中篩選得到113個差異代謝物（占比56.50%）。其中94個差異代謝物上調（占比83.19%）。差異代謝物的MESA分析顯示，有17個代謝通路在ESCC腫瘤中有顯著擾動。其中10個通路參與氨基酸代謝，這表明在人類ESCC中的氨基酸代謝受到主要干擾。而一個ESCC細胞系KYSE150細胞培養上清的分析顯示，ESCC細胞消耗了更多的氨基酸包括胱氨酸、精氨酸、脯氨酸及其他氨基酸。
（4）整合分析：研究者利用蛋白質組和代謝組的結果對最受干擾的精氨酸和脯氨酸代謝通路進行整合網絡分析，結果表明ESCC腫瘤選擇性表達多個代謝酶，以加速氨基酸的生產。另外，考慮到代謝物在細胞表型決定中的重要作用，研究者分析了能表征ESCC重要細胞表型的差異蛋白物和差異蛋白質間的相關性。13個代謝物與乙-醛脫氫酶1（ALDH1，一個ESCC干性標志物）正相關。該結果表明，變化的代謝物可能參與影響ESCC的干性。
4.?鑒定有預后潛力的蛋白標志物（上調差異蛋白質）
接下來， 研究者通過分析ESCC癌 vs 癌旁的差異蛋白尋找與患者生存相關及參與ESCC進展的蛋白。單因素Cox模型分析共得到118個有預后潛力的蛋白。這其中，66個蛋白與疾病復發或死亡風險正相關，而剩余蛋白與疾病復發或死亡風險負相關。KEGG富集分析顯示，這118個蛋白主要富集在吞噬體、補體和凝血級聯、P53信號通路、果糖和甘露糖代謝等通路。
66個與疾病復發或死亡風險正相關的蛋白中有23個蛋白的蛋白和mRNA表達變化趨勢一致，表明這些蛋白是受到轉錄水平的調控。而其他蛋白的蛋白變化趨勢和mRNA變化趨勢不一致，表明是受到轉錄后調控。值得注意的是，14個基因，包括HACD2、RBM3、MRPL14、PCNP、XPNPEP3、TBC1D5、BPTF、CEP170B、PTPN13、NAA50、SNRPF、NUP43、FBL和CHCHD2在蛋白質和mRNA水平上都明顯上調。研究者在4-NQO（4-**喹-啉 N-氧化物）誘導的ESCC小鼠中檢測了這些基因的mRNA轉錄。其中3個基因，RBM3、BPTF和FBL，在ESCC小鼠的食道組織中相對于對照組小鼠明顯增加，表明這三個基因在ESCC中的上調在不同物種中是保守的。接下來，研究者選擇了5個在ESCC腫瘤中上調最多的蛋白，包括HACD2、RBM3、MRPL14、PCNP和XPNPEP3，以及BPTF和FBL進行進一步研究。
?5. FBL可作為不利預后的生物標志物
研究者在第二個隊列（n=41）組織樣本中檢測了前述7個蛋白的表達量，并評估這些蛋白的預后潛力。結果表明，FBL、XPNPEP3和BPTF在癌組織中顯著上調。研究者繼續在ESCC細胞系敲減FBL、XPNPEP3和BPTF，檢測這三個基因對ESCC惡性的影響。結果表明，FBL缺失顯著下調細胞增殖標志物PCNA的表達，并且顯著抑制ESCC細胞的生長。此外，FBL缺失顯著抑制了PI3K/AKT信號通路，該通路是促進細胞G1/S期轉換的重要信號通路。體內動物水平上的結果顯示，FBL缺失顯著抑制移植瘤小鼠腫瘤的生長。而XPNPEP3和BPTF并未影響ESCC細胞的生長。綜合以上結果表明，是FBL而非XPNPEP3和BPTF，通過激活PI3K/AKT信號通路，促進細胞G1/S期轉換，在ESCC細胞生長中發揮重要作用。
緊接著，研究者在第三個ESCC隊列（n=100）中使用IHC檢測了FBL的表達，結果證實了FBL在ESCC腫瘤中的高表達。重要的是，高的FBL蛋白表達預示著ESCC患者的總生存率和無復發生存率較低。而TCGA RNA-seq數據的分析顯示，FBL的高mRNA水平與ESCC患者糟糕的總生存率無關，這表明FBL mRNA與ESCC患者的預后沒有關系?？傮w，這些發現表明，腫瘤組織中高表達FBL蛋白預示著ESCC患者預后不佳。
6.?發現腫瘤抗原和靶向潛在的腫瘤驅動因子和重要激酶的藥物
新腫瘤抗原(包括CT抗原)的鑒定將為開發用于癌癥免疫治療的疫苗提供更多的機會。通過分析蛋白質組結果，研究者發現了4個已知的CT抗原MAGEB3、MAGEA4、MAGEA8和SPAG9在ESCC組織中顯著上調，變化倍數（FC）從1.84到223.50。緊接著，研究者將蛋白質組結果與已知的潛在癌癥驅動因子列表和激酶列表進行比較，分別發現了32個潛在腫瘤驅動因子和29個激酶在ESCC癌組織中有4倍以上的表達上調。通過在兩個藥物數據庫Drugbank和PKIDB進行檢索發現，21.88%(7/32)的癌癥驅動因子和86.21%(25/29)的激酶有靶向抑制劑。這些抑制劑可以作為ESCC的新療法進行測試。
研究總結
研究者對24對人食管鱗狀細胞癌（ESCC）癌組織和配對的正常鄰近組織進行了轉錄組、蛋白質組、磷酸化蛋白質組和代謝組特征分析，以確定ESCC的新的分子特征和潛在的治療靶點。結果顯示，有一小群基因與ESCC活躍的轉錄后和翻譯后調控有關。通過分析蛋白質組學、磷酸化蛋白質組學和代謝組學數據，揭開了與癌癥病因密切相關的ESCC相關信號和代謝途徑的網絡。蛋白質組和磷酸化蛋白質組數據分析顯示，參與RNA轉錄、加工和代謝的某些途徑在ESCC中受到激活。此外，研究者發現了與ESCC預后密切相關的蛋白質，其中FBL對ESCC細胞的體外和體內生長至關重要，且FBL的高表達預示著不利的預后。最后，研究者分析發現了ESCC癌組織中的CT抗原、腫瘤驅動因子及激酶，并分析了已有的靶向這些分子的藥物，這將為ESCC新療法的開發提供啟發。
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