對于具有遺傳性疾病的病人而言，人生中收到的最寶貴的禮物應(yīng)該是許久沒有感受過的健康。
?? 提到基因編輯，相信大家目前最熟悉，也是聽到次數(shù)最多的，應(yīng)該是CAS9或者由CAS9所衍生出來的KI之類的基因編輯技術(shù)。同時隨著FDA批準了其治療遺傳性血管性水腫（HAE）的體內(nèi)CRISPR療法NTLA-2002的研究型新藥以及最為轟動的英國藥品和保健產(chǎn)品監(jiān)管機構(gòu)（MHRA）宣告批準由Vertex和CRISPR Therapeutics共同研發(fā)的全球首個CRISPR/Cas9基因編輯藥物Casgevy附條件上市，曾經(jīng)獲得諾獎的技術(shù)再次進入人們的視野。基因編輯的臨床應(yīng)用也開始初露鋒芒，但有褒有貶，CAS9雖然表現(xiàn)力不俗，卻也依舊有屬于他的局限性，特別是基于雙鏈DSB（雙鏈DNA斷裂）所帶來的非同源重組修復(fù)產(chǎn)生的結(jié)果相對隨機且不可控，雖然缺失了，但是缺口處的序列卻可能并不如我們所預(yù)期的那樣，這可能會帶來一些其他無法預(yù)料的結(jié)果。同年，一篇名為“Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs【1】”的研究論文提出了屬于他的解決方法——胞嘧啶堿基編輯器。
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圖2：胞嘧啶堿基編輯器的原理【2】
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?? 那么可能有一個問題就產(chǎn)生了，什么是胞嘧啶堿基編輯器？OK，我們先將目光從這篇文章上移開，將注意力放到這一項關(guān)注單堿基編輯的技術(shù)上。雖然這項技術(shù)被稱為胞嘧啶堿基編輯器，但他還是脫胎于CAS9，結(jié)構(gòu)上，第一代的BE1由rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脫氨酶)和完全失去切割活性的dCas9組成（rAPOBEC1-XTEN-dCas9），使得一個目標 DNA 堿基以可編程方式直接，不可逆轉(zhuǎn)地轉(zhuǎn)換成另一個，而不需要 dsDNA 骨架切割或供體模板。我們設(shè)計了 CRISPR/Cas9和胞苷脫氨酶的融合物，其保留了用指導(dǎo) RNA 編程的能力，不誘導(dǎo) dsDNA 斷裂，并介導(dǎo)胞苷向尿苷的直接轉(zhuǎn)化，從而影響 C → T (或 G → A)取代。由此產(chǎn)生的“堿基編輯器”在大約五個核苷酸(nt)的窗口內(nèi)轉(zhuǎn)換胞苷，并能有效地糾正與人類疾病相關(guān)的各種點突變。但是在體和體外細胞中的實驗差異使研究人員發(fā)現(xiàn)一類對該替換方式產(chǎn)生影響的物質(zhì)——細胞內(nèi)存在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，那么發(fā)現(xiàn)了問題就要去解決它，研究人員通過在dCas9后面融合了來自噬菌體PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI)抑制UDG的活性，并構(gòu)建出第二代的胞嘧啶堿基編輯器BE2（rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI）。為了進一步提高編輯效率，David Liu實驗室結(jié)合細胞的內(nèi)源修復(fù)機制開發(fā)了第三代堿基編輯器BE3（rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI）。
BE3將BE2中的dCas9替換為nCas9(D10A)，可特異性地在非編輯鏈上產(chǎn)生一個缺口，進而刺激細胞內(nèi)的堿基錯配修復(fù)途徑(MMR)，以含有U的編輯鏈作為模板進行修復(fù)，從而增加編輯效率。BE3的編輯效率比BE2提高了2~6倍，平均約為37%，該堿基編輯器是目前較為廣泛使用的CBE版本，在四種轉(zhuǎn)化的人和鼠細胞系中，融合尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)并使用靶向未編輯鏈的 Cas9切口酶的第二代和第三代堿基編輯器操縱細胞 DNA 修復(fù)反應(yīng)以有利于所需的堿基編輯結(jié)果，導(dǎo)致永久校正總細胞 DNA 的15-75%【2】
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圖3：不同胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果【2
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?? 在后續(xù)的研究，研究者發(fā)現(xiàn)在某些基因座上，諸如 BE3的堿基編輯器產(chǎn)生不希望的副產(chǎn)品，其中目標 C: G 堿基對轉(zhuǎn)換為 G: C 或 A: T 堿基對，而不是所需的 T: A 產(chǎn)物。在這里，研究者闡述了堿基編輯產(chǎn)品純度的決定因素，并確定了產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)品所需的UDG活性。通過分析單個 DNA 測序讀數(shù)，發(fā)現(xiàn)阻斷對于單個 C 在編輯窗口內(nèi)的目標基因座來說，阻斷UDG的作用是特別重要的，以最小化不需要的產(chǎn)物。利用這些見解，我們設(shè)計了第四代堿基編輯器 BE4 rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI (化膿性鏈球菌 Cas9衍生的堿基編輯器)和 SaBE4(金黃色葡萄球菌 Cas9衍生的 BE4)，與之前描述的包括 BE3在內(nèi)的堿基編輯器相比，它們以更高的效率進行堿基編輯，并大大提高了產(chǎn)品純度。最后，研究者開發(fā)了另外的堿基編輯器ーーBE3-Gam，SaBE3-Gam，BE4-Gam 和 SaBE4-Gam ーー使用噬菌體 Mu dsDNA (雙鏈 DNA)末端結(jié)合蛋白 Gam 來最小化堿基編輯期間不需要的插入缺失的形成，并進一步提高產(chǎn)品純度，沒有明顯的活性損失【3】。
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圖4：BE4和BE3胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果【3】
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圖5：GAM-BE4和GAM-BE3胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果【3】
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?? 了解完什么是胞嘧啶單堿基編輯器之后，我們再回到開頭的那篇文獻，通過破壞抑制性調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域重新激活沉默的 γ-珠蛋白表達為治療 β-血紅蛋白病提供了一種治療策略。在這里，研究者使用胞嘧啶堿基編輯器(tBE) ，破壞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序的造血干細胞。通過用 tBE 進行六個基序的功能篩選，作者發(fā)現(xiàn)直接破壞 HBG1/2啟動子中的 BCL11A 結(jié)合基序觸發(fā)了最高的 γ-珠蛋白表達。通過使用 Cas9核酸酶或常規(guī) BE (ABE8e 和 hA3A-BE3)與其它臨床和臨床前策略并行比較，發(fā)現(xiàn) tBE 介導(dǎo)的 HBG1/2啟動子處 BCL11A 結(jié)合基序的破壞觸發(fā)了健康和 β-地中海貧血患者造血干/祖細胞中最高的胎兒血紅蛋白，同時沒有顯示可檢測的 DNA 或 RNA 脫靶突變。TBE 持續(xù)的治療性編輯持續(xù)增殖造血干細胞，表明 tBE 介導(dǎo)的 HBG1/2啟動子編輯是治療 β-血紅蛋白病的安全有效的策略。
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圖6：胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果【1】
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??? 伴隨著基因治療的發(fā)展，精準醫(yī)療會漸漸成為這種治療方式的主旋律，減少不必要的突變和不可預(yù)測之外的情況的產(chǎn)生更是重中之重，在這個基礎(chǔ)上工具載體的選擇也就格外重要。吉凱基因擁有豐富的sgRNA設(shè)計經(jīng)驗，完善的病毒包裝生產(chǎn)體系，嚴格的質(zhì)控標準，為廣大科研工作者提供可靠的基因調(diào)控產(chǎn)品。同時吉凱基因的CRISPR-Cas9系列產(chǎn)品已獲得MIT及哈佛大學(xué)在專利上的聯(lián)合授權(quán)，歡迎大家咨詢訂購。
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參考文獻…
1. Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs.
2. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage.
3. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity.