對于具有遺傳性疾病的病人而言，人生中收到的最寶貴的禮物應該是許久沒有感受過的健康。

?? 提到基因編輯，相信大家目前最熟悉，也是聽到次數最多的，應該是CAS9或者由CAS9所衍生出來的KI之類的基因編輯技術。同時隨著FDA批準了其治療遺傳性血管性水腫（HAE）的體內CRISPR療法NTLA-2002的研究型新藥以及最為轟動的英國藥品和保健產品監管機構（MHRA）宣告批準由Vertex和CRISPR Therapeutics共同研發的全球首個CRISPR/Cas9基因編輯藥物Casgevy附條件上市，曾經獲得諾獎的技術再次進入人們的視野?；蚓庉嫷呐R床應用也開始初露鋒芒，但有褒有貶，CAS9雖然表現力不俗，卻也依舊有屬于他的局限性，特別是基于雙鏈DSB（雙鏈DNA斷裂）所帶來的非同源重組修復產生的結果相對隨機且不可控，雖然缺失了，但是缺口處的序列卻可能并不如我們所預期的那樣，這可能會帶來一些其他無法預料的結果。同年，一篇名為“Base editing of the HBG promoter induces potent fetal hemoglobin expression with no detectable off-target mutations in human HSCs^【1】”的研究論文提出了屬于他的解決方法——胞嘧啶堿基編輯器。

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圖2：胞嘧啶堿基編輯器的原理^【2】

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?? 那么可能有一個問題就產生了，什么是胞嘧啶堿基編輯器？OK，我們先將目光從這篇文章上移開，將注意力放到這一項關注單堿基編輯的技術上。雖然這項技術被稱為胞嘧啶堿基編輯器，但他還是脫胎于CAS9，結構上，第一代的BE1由rAPOBEC1(大鼠胞嘧啶脫氨酶)和完全失去切割活性的dCas9組成（rAPOBEC1-XTEN-dCas9），使得一個目標 DNA 堿基以可編程方式直接，不可逆轉地轉換成另一個，而不需要 dsDNA 骨架切割或供體模板。我們設計了 CRISPR/Cas9和胞苷脫氨酶的融合物，其保留了用指導 RNA 編程的能力，不誘導 dsDNA 斷裂，并介導胞苷向尿苷的直接轉化，從而影響 C → T (或 G → A)取代。由此產生的“堿基編輯器”在大約五個核苷酸(nt)的窗口內轉換胞苷，并能有效地糾正與人類疾病相關的各種點突變。但是在體和體外細胞中的實驗差異使研究人員發現一類對該替換方式產生影響的物質——細胞內存在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，那么發現了問題就要去解決它，研究人員通過在dCas9后面融合了來自噬菌體PBS的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑(UGI)抑制UDG的活性，并構建出第二代的胞嘧啶堿基編輯器BE2（rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI）。為了進一步提高編輯效率，David Liu實驗室結合細胞的內源修復機制開發了第三代堿基編輯器BE3（rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI）。

BE3將BE2中的dCas9替換為nCas9(D10A)，可特異性地在非編輯鏈上產生一個缺口，進而刺激細胞內的堿基錯配修復途徑(MMR)，以含有U的編輯鏈作為模板進行修復，從而增加編輯效率。BE3的編輯效率比BE2提高了2~6倍，平均約為37%，該堿基編輯器是目前較為廣泛使用的CBE版本，在四種轉化的人和鼠細胞系中，融合尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)并使用靶向未編輯鏈的 Cas9切口酶的第二代和第三代堿基編輯器操縱細胞 DNA 修復反應以有利于所需的堿基編輯結果，導致永久校正總細胞 DNA 的15-75%^【2】

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圖3：不同胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果^【2

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?? 在后續的研究，研究者發現在某些基因座上，諸如 BE3的堿基編輯器產生不希望的副產品，其中目標 C: G 堿基對轉換為 G: C 或 A: T 堿基對，而不是所需的 T: A 產物。在這里，研究者闡述了堿基編輯產品純度的決定因素，并確定了產生不需要的副產品所需的UDG活性。通過分析單個 DNA 測序讀數，發現阻斷對于單個 C 在編輯窗口內的目標基因座來說，阻斷UDG的作用是特別重要的，以最小化不需要的產物。利用這些見解，我們設計了第四代堿基編輯器 BE4 rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI (化膿性鏈球菌 Cas9衍生的堿基編輯器)和 SaBE4(金黃色葡萄球菌 Cas9衍生的 BE4)，與之前描述的包括 BE3在內的堿基編輯器相比，它們以更高的效率進行堿基編輯，并大大提高了產品純度。最后，研究者開發了另外的堿基編輯器ーーBE3-Gam，SaBE3-Gam，BE4-Gam 和 SaBE4-Gam ーー使用噬菌體 Mu dsDNA (雙鏈 DNA)末端結合蛋白 Gam 來最小化堿基編輯期間不需要的插入缺失的形成，并進一步提高產品純度，沒有明顯的活性損失^【3】。

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圖4：BE4和BE3胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果^【3】

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圖5：GAM-BE4和GAM-BE3胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果^【3】

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?? 了解完什么是胞嘧啶單堿基編輯器之后，我們再回到開頭的那篇文獻，通過破壞抑制性調節結構域重新激活沉默的 γ-珠蛋白表達為治療 β-血紅蛋白病提供了一種治療策略。在這里，研究者使用胞嘧啶堿基編輯器(tBE) ，破壞轉錄因子結合基序的造血干細胞。通過用 tBE 進行六個基序的功能篩選，作者發現直接破壞 HBG1/2啟動子中的 BCL11A 結合基序觸發了最高的 γ-珠蛋白表達。通過使用 Cas9核酸酶或常規 BE (ABE8e 和 hA3A-BE3)與其它臨床和臨床前策略并行比較，發現 tBE 介導的 HBG1/2啟動子處 BCL11A 結合基序的破壞觸發了健康和 β-地中海貧血患者造血干/祖細胞中最高的胎兒血紅蛋白，同時沒有顯示可檢測的 DNA 或 RNA 脫靶突變。TBE 持續的治療性編輯持續增殖造血干細胞，表明 tBE 介導的 HBG1/2啟動子編輯是治療 β-血紅蛋白病的安全有效的策略。

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圖6：胞嘧啶堿基編輯器的編輯效果^【1】

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??? 伴隨著基因治療的發展，精準醫療會漸漸成為這種治療方式的主旋律，減少不必要的突變和不可預測之外的情況的產生更是重中之重，在這個基礎上工具載體的選擇也就格外重要。吉凱基因擁有豐富的sgRNA設計經驗，完善的病毒包裝生產體系，嚴格的質控標準，為廣大科研工作者提供可靠的基因調控產品。同時吉凱基因的CRISPR-Cas9系列產品已獲得MIT及哈佛大學在專利上的聯合授權，歡迎大家咨詢訂購。

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