題目：Integrative detection and analysis of structural variation in cancer genomes
期刊：Nature genetics
影響因子：27.125
研究背景
結(jié)構(gòu)變異(SVs)，包括倒置、刪除、復(fù)制陽(yáng)離子和易位，是大多數(shù)癌癥基因組的標(biāo)志。復(fù)發(fā)性SVs的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)基因組織和表達(dá)的分子效應(yīng)促進(jìn)我們對(duì)腫瘤發(fā)生的認(rèn)識(shí)。許多致癌基因已被確認(rèn)為復(fù)發(fā)易位的產(chǎn)物，并為藥物治療特別是造血惡性腫瘤提供了成功的靶點(diǎn)。盡管它很重要，但在癌癥基因組中鑒定SVs仍然具有挑戰(zhàn)性。在這里，作者利用高通量染色體構(gòu)象捕獲(Hi-C)、集成光學(xué)映射和全基因組測(cè)序，系統(tǒng)地檢測(cè)正常或癌癥樣本中的SVs，意圖探究癌基因組中，SVs對(duì)突變驅(qū)動(dòng)因素的影響。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1. 檢測(cè)腫瘤基因組SV的方法
為了評(píng)估對(duì)SVs不同檢測(cè)方法的能力，作者選取了8個(gè)癌細(xì)胞系和1個(gè)典型正常對(duì)照（GM12878）（見(jiàn)表1），對(duì)它們的WGS、光學(xué)測(cè)圖和Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行比較（圖1a），發(fā)現(xiàn)三種方法均檢測(cè)到Caki2細(xì)胞中染色體2和3的易位（圖1b），通過(guò)觀察同一區(qū)域DNA復(fù)制時(shí)間譜的顯著變化，也證實(shí)了這種易位。同時(shí)觀察到，與正常細(xì)胞相比，癌癥基因組顯示出更多的重組事件，如圖1c所示環(huán)狀基因組結(jié)構(gòu)剖面。
表1腫瘤和正常細(xì)胞系的高置信度的SVs數(shù)
圖1 腫瘤基因組SV檢測(cè)的總體策略
2. 利用Hi-C數(shù)據(jù)檢測(cè)大規(guī)模重排
在Hi-C實(shí)驗(yàn)中，正常細(xì)胞染色體間相互作用非常罕見(jiàn)（圖2a左）。然而，這這種情況在癌細(xì)胞中卻相反。例如Caki2癌癥在細(xì)胞中，觀察到了強(qiáng)烈的染色體間相互作用（圖2a右），這可能是由于6號(hào)染色體和8號(hào)染色體的融合。但是關(guān)于癌細(xì)胞的染色體相互作用增加的信號(hào)是由于重組還是三維基因組組織的變異導(dǎo)致的還不清楚，因此針對(duì)這一問(wèn)題，作者首先為“正常”的三維基因組組織特征建立了概率模型，包括位點(diǎn)、TADs、A/B compartments之間的基因組距離，發(fā)現(xiàn)小染色體和次端粒區(qū)域之間相互作用的增加。并且在重排的情況下，兩個(gè)重排區(qū)域的基因是融合的，因其改變了位點(diǎn)之間的線性距離，從而也導(dǎo)致了與局部預(yù)期交互頻率的偏差（圖2a、b）。其次，作者利用Hi-C數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組SVs檢測(cè)，這一檢測(cè)屬于一種新型算法。該算法具體體現(xiàn)為：作者首先用一個(gè)特征良好的慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系（K562）來(lái)評(píng)估，并將結(jié)果與已發(fā)表的核型進(jìn)行比較。在19個(gè)Hi-C預(yù)測(cè)的重排中，11個(gè)可以確認(rèn)，其余8個(gè)是新的。由于這8個(gè)均在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，它們不太可能是克隆進(jìn)化的產(chǎn)物。隨后，作者進(jìn)行了FISH實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證新的預(yù)測(cè)易位。使用Hi-C數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)的19個(gè)易位中有18個(gè)通過(guò)FISH或以前的核型驗(yàn)證，結(jié)果表明，新算法能夠識(shí)別具有高特異性的大規(guī)模結(jié)構(gòu)變異。
最后，將Hi-C分析擴(kuò)展到27個(gè)癌細(xì)胞系和9個(gè)核型正常細(xì)胞系(圖2d)，發(fā)現(xiàn)在癌細(xì)胞中報(bào)告了25次重排，在正常細(xì)胞中幾乎沒(méi)有發(fā)生這種情況，染色體間和染色體內(nèi)重排的比率約為2:1(所有細(xì)胞系中為424比274)。因此，新算法似乎可以識(shí)別大部分的大SVs，只有4.3%的無(wú)法識(shí)別。
圖2 利用Hi-C數(shù)據(jù)檢測(cè)大規(guī)模重排
3. 不同方法檢測(cè)SVs的比較
通過(guò)光學(xué)映射和WGS在每個(gè)癌細(xì)胞株中鑒定了數(shù)千個(gè)遺傳物質(zhì)的增加或損耗，光學(xué)映射檢測(cè)到的缺失比WGS更少但范圍更大。在T47D細(xì)胞中，WGS檢測(cè)到2943個(gè)缺失，中位大小為552 bp，而Irys檢測(cè)到1128個(gè)缺失，中位大小為1 335 bp（圖3a,b）。其中85% WGS檢測(cè)到的缺失被Irys遺漏，且其中78%的中位大小小于1kb。由于其分辨率受兩個(gè)刻痕點(diǎn)之間的最小距離的限制，這些特征很可能被光學(xué)映射所忽略。Irys預(yù)測(cè)的缺失中有3%與多個(gè)較小的WGS缺失重疊，在這些情況下，這些WGS缺失的總和大小接近Irys檢測(cè)到的缺失，但在Irys檢測(cè)到的缺失中，有15%沒(méi)有被WGS捕獲。
作者測(cè)試了Irys檢測(cè)到的一部分缺失，其中87.5%的缺失（16個(gè)缺失中的14個(gè)）通過(guò)了PCR驗(yàn)證。光學(xué)映射可以識(shí)別WGS reads沒(méi)有被映射的重復(fù)區(qū)域內(nèi)的缺失（圖3c），以及在斷點(diǎn)周圍可映射性較低的區(qū)域。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)WGS、Irys和Hi-C可以檢測(cè)到不同染色體間大規(guī)模重排，類似基因組的非模板化添加堿基或外源DNA序列，如病毒的堿基，它可能來(lái)自第三條染色體因其太短而無(wú)法識(shí)別。如圖3d所示，光學(xué)映射到局部結(jié)構(gòu)，WGS用來(lái)確定斷點(diǎn)，WGS通過(guò)定位斷點(diǎn)和Hi-C數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證同一等位基因上幾個(gè)相鄰重排。總之，采用互補(bǔ)技術(shù)的綜合方法對(duì)于更全面地了解癌癥基因組的結(jié)構(gòu)變化至關(guān)重要。
圖3 不同方法檢測(cè)SVs的比較
4. SVs對(duì)增強(qiáng)子的影響
拷貝數(shù)改變（CNAs）代表癌癥的另一類遺傳變異。作者在T47D乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)CNAs進(jìn)行了分析，并與560例乳腺癌患者的WGS數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較。在10個(gè)最常見(jiàn)的突變癌基因中，有8個(gè)在T47D癌細(xì)胞中被擴(kuò)增，ATRX、CDKN1B等腫瘤抑制基因表達(dá)缺失（圖4a），說(shuō)明T47D細(xì)胞反映了乳腺癌的CNA表達(dá)情況。
作者進(jìn)一步比較了T47D和人乳腺上皮細(xì)胞(HMECs)的RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)雜合性（LOH）缺失和純合缺失導(dǎo)致基因表達(dá)顯著降低，并且在其他癌細(xì)胞株中也觀察到這一點(diǎn)。作者在25個(gè)COSMIC（癌癥體細(xì)胞突變目錄）發(fā)現(xiàn)與腫瘤相關(guān)的基因，大多數(shù)（76%）顯示轉(zhuǎn)錄降低。而已知的癌基因（如MYC）和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)基因（如CDKN2A和CDKN2B）廣泛擴(kuò)增。
為了研究SVs是否可以通過(guò)破壞遠(yuǎn)端調(diào)控元件來(lái)影響癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。作者重點(diǎn)比較了T47D乳腺癌細(xì)胞與人乳腺上皮細(xì)胞（HMECs）。主要方法是使用ENCODE 聯(lián)合 (URLs)的H3K27ac染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)HMECs中的增強(qiáng)子，并將增強(qiáng)子與T47D中的缺失區(qū)域進(jìn)行比較。結(jié)果表明，GNB4基因下游的3.4 kb缺失與乳腺組織特異性增強(qiáng)子重疊。由于基因組擴(kuò)增，該區(qū)域有6個(gè)拷貝，其中5個(gè)帶有這種缺失，只有單拷貝的增強(qiáng)子沒(méi)有被破壞。
HMECs中的Hi-C數(shù)據(jù)表明GNB4可能受到單拷貝增強(qiáng)子的調(diào)控。更重要的是，它是該區(qū)域唯一表達(dá)減少的基因，該區(qū)域其余基因的表達(dá)高度上調(diào)，可能是由于拷貝數(shù)增加（圖4c）。此外，發(fā)現(xiàn)缺失的增強(qiáng)子位于乳腺癌相關(guān)通路的基因附近（圖4d），并且連接這些缺失的增強(qiáng)子相關(guān)的基因表達(dá)水平降低（圖4e）。總的來(lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明癌癥基因組的缺失可能經(jīng)常影響增強(qiáng)子，并可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生。
圖4 SVs對(duì)增強(qiáng)子的影響
5. 結(jié)構(gòu)變異對(duì)三維基因組組織的影響
基因突變會(huì)破壞拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域（TADs）并產(chǎn)生“新TADs（neo-TADs）”，導(dǎo)致發(fā)育障礙中的基因表達(dá)失調(diào)。為了研究SVs對(duì)三維基因組組織的影響，作者利用Hi-C數(shù)據(jù)鑒定了20個(gè)癌細(xì)胞株中的SVs，系統(tǒng)地研究了結(jié)構(gòu)變化對(duì)TAD結(jié)構(gòu)的影響，觀察到neo-TADs是癌細(xì)胞大規(guī)模基因組重排的結(jié)果。如圖5a所示，在PANC-1細(xì)胞中，染色體9和18的融合形成了一個(gè)neo-TAD。此外，發(fā)現(xiàn)許多由SVs誘導(dǎo)的neo-TADs在癌細(xì)胞中含有已知癌癥驅(qū)動(dòng)基因，如ERBB2、ETV1、ETV4、MYC、TERT等。
為了探討neo-TAD形成是否是癌癥基因組SV重排的一般結(jié)果，作者對(duì)每個(gè)細(xì)胞系中的所有斷點(diǎn)交叉Hi-C信號(hào)進(jìn)行了匯總分析。如圖5b所示，觀察到染色體間Hi-C信號(hào)形成一個(gè)尖銳的三角形（虛線），表明由于重排而形成的融合TAD。當(dāng)使用隨機(jī)邊界位置打亂TADs進(jìn)行同樣的分析時(shí)，沒(méi)有觀察到這種情況。這些結(jié)果表明，癌癥中的結(jié)構(gòu)變異可以重組TAD結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致TAD融合和調(diào)節(jié)環(huán)境的改變（圖5c）。
接著，作者研究了neo-TADs對(duì)基因表達(dá)的影響。在8個(gè)癌細(xì)胞系中，觀察到包含重排的TADs基因比未重排的TADs基因表現(xiàn)出更大的等位基因偏差，這表明neo-TADs可能導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。接著，作者檢查了3個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的Hi-C數(shù)據(jù)，并比較了MYC的表達(dá)。其中SK-N-DZ具有較高的MYCN/N-myc表達(dá)（圖5e），其余兩個(gè)SK-N-SH和SK-N-AS具有較高的MYC/c-Myc表達(dá)。值得注意的是，在兩個(gè)高MYC表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（SK-N-SH和SK-N-AS）中，發(fā)現(xiàn)了MYC基因附近存在易位。據(jù)癌癥細(xì)胞系百科全書數(shù)據(jù)記載，這兩個(gè)細(xì)胞系中沒(méi)有MYC擴(kuò)增，而作者觀察了兩種情況下包含MYC基因的neo-TADs的形成（圖5f，g），表明neo-TADs的形成可能與MYC激活有關(guān)。綜上所述，neo-TADs的產(chǎn)生是癌癥基因組重組的結(jié)果。
圖5 重排和TAD融合
文章小結(jié)
作者利用高通量染色體構(gòu)象捕獲（Hi-C）、集成光學(xué)映射和全基因組測(cè)序，系統(tǒng)地檢測(cè)正常或癌癥樣本中的SVs，發(fā)現(xiàn)光學(xué)映射和Hi-C能有效檢測(cè)大而復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化，高覆蓋的WGS能識(shí)別高分辨率SVs。此外，還發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)基因組變異而導(dǎo)致的三維(3D)基因組組織改變的實(shí)例，例如拓?fù)潢P(guān)聯(lián)域(TADs)的形成或分解，這表明結(jié)構(gòu)變異在腫瘤發(fā)生的基因失調(diào)中起著關(guān)鍵作用。
解析文獻(xiàn)
Jesse R. Dixon, Jie Xu ,et al. Integrative detection and analysis of structural variation in cancer genomes. Nature Genetics, 2018, 50: 1388–1398.
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