研究背景
肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）是一種嚴(yán)重的呼吸道疾病，能導(dǎo)致肺功能進(jìn)行性喪失。PF的平均生存期僅有2-4年，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)主要的難治性疾病之一。目前，PF的臨床治療手段主要是藥物干預(yù)，氧療、肺移植等。這些治療手段雖然能夠在一定程度上緩解肺纖維化的癥狀，卻不能阻止肺纖維化的進(jìn)程。因此，當(dāng)前臨床亟需針對(duì)PF的有效治療手段。
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近年來(lái)的多項(xiàng)研究指出，肺纖維化和線粒體受損密切相關(guān)。在外界刺激下，肺部的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞等的線粒體受到損傷，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，從而激活下游纖維化通路。為此，針對(duì)PF的發(fā)病機(jī)制，以受損線粒體為治療靶點(diǎn)，進(jìn)行線粒體補(bǔ)充治療有望阻止PF的進(jìn)程。
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其中，線粒體補(bǔ)充治療可分為直接的線粒體移植，和間接的細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移。對(duì)于直接的線粒體移植來(lái)說(shuō)，其療效雖得到廣泛的確證，卻存在不少應(yīng)用限制，例如提取步驟繁瑣、易失活、細(xì)胞攝取效率低、缺乏靶向性等。而另一方面，利用細(xì)胞自發(fā)的線粒體轉(zhuǎn)移能力，將天然細(xì)胞作為線粒體載體，可以避免線粒體移植的缺陷，例如其無(wú)提取步驟、可以保障線粒體活力，具備單向轉(zhuǎn)移能力。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell，MSC）由于來(lái)源豐富、低免疫原性、炎癥趨向性、低氧化損傷水平、低能量需求而常被用作線粒體的靶向遞送載體。然而，MSC固有的線粒體轉(zhuǎn)移效率較低，這限制了線粒體治療的療效。
研究思路
浙江大學(xué)藥學(xué)院高建青教授/張?zhí)碓囱芯繂T團(tuán)隊(duì)前期利用氧化鐵納米粒改良的間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建了第一代“干細(xì)胞超級(jí)電池”（V1.0），實(shí)現(xiàn)了向受損肺細(xì)胞的靶向線粒體補(bǔ)充治療（Science Advances. 2021,7(40):eabj0534，當(dāng)期特別推薦文章）。然而，第一代改良技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)受損部位的持續(xù)、高效線粒體輸送，因而在已經(jīng)進(jìn)展的肺纖維化小鼠上的療效有限。為解決這一難題，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了第二代“干細(xì)胞超級(jí)電池”（V2.0，Pg-Fe-hMSC），聯(lián)合使用吡格列酮和氧化鐵納米粒，以同時(shí)提高M(jìn)SC的線粒體數(shù)量和遞送效率，從而實(shí)現(xiàn)靶向受損肺細(xì)胞的持續(xù)、高效線粒體“再充電”。Pg-Fe-hMSC在已經(jīng)進(jìn)展的嚴(yán)重肺纖維化小鼠模型上展現(xiàn)了良好的療效（圖1）。
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該論文在近期被Nature Communications（IF=16.6）推薦為編輯精選論文（Editors’ Highlights）。Nature Communications Editors’ Highlights為Nature Communications編輯部精選的近期發(fā)表的50篇最優(yōu)論文。
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圖1.通過(guò)構(gòu)建第二代“干細(xì)胞超級(jí)電池”（V2.0，Pg-Fe-hMSC），有效干預(yù)肺纖維化的進(jìn)展。
研究結(jié)果
首先，研究者設(shè)置系列的吡格列酮處理濃度及時(shí)間，以篩選出針對(duì)人胎盤(pán)來(lái)源MSC（hMSC）最佳的處理?xiàng)l件。在最佳處理?xiàng)l件下，吡格列酮能夠有效地提高h(yuǎn)MSC胞內(nèi)的線粒體含量。通過(guò)熒光共聚焦圖像、流式細(xì)胞術(shù)、PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提高h(yuǎn)MSC胞內(nèi)的線粒體含量可以在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞間的線粒體轉(zhuǎn)移，且這一過(guò)程與PGC-1α相關(guān)（圖2）。
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圖2.吡格列酮提高h(yuǎn)MSC的線粒體含量，促進(jìn)線粒體的高效和持續(xù)遞送。
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進(jìn)一步地，研究者們比較不同處理的hMSC對(duì)受損肺細(xì)胞的保護(hù)作用。通過(guò)比較各組細(xì)胞的胞內(nèi)ATP水平、ROS含量、線粒體膜電位、細(xì)胞活力，可以發(fā)現(xiàn)，Pg-Fe-hMSC表現(xiàn)出了更好的保護(hù)作用。隨后，分別使用PGC-1α-siRNA和PGC-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hMSC，以下調(diào)或上調(diào)hMSC的PGC-1α表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGC-1α的下調(diào)降低了hMSC的保護(hù)作用，而PGC-1α的上調(diào)提高了hMSC的保護(hù)作用。這一結(jié)果表明，持續(xù)高效的線粒體遞送能力有助于有效恢復(fù)嚴(yán)重受損的肺上皮細(xì)胞的線粒體功能（ATP水平），降低胞內(nèi)的過(guò)量ROS，進(jìn)而有效拯救受損的肺上皮細(xì)胞（圖3）。
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圖3.Pg-Fe-hMSC的持續(xù)高效線粒體遞送，有助于受損肺上皮細(xì)胞的線粒體功能恢復(fù)。
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基于前述研究結(jié)果，繼續(xù)考察Pg-Fe-hMSC對(duì)處于疾病進(jìn)展期PF小鼠的治療作用。分別在BLM誘導(dǎo)肺損傷后的第7、10天尾靜脈注射給予PF小鼠相同劑量的hMSC、Pg-hMSC、Fe-hMSC、Pg-Fe-hMSC。在BLM注射后的第28天，未接受任何治療的PF小鼠生存率降至60%左右，而各組hMSC的干預(yù)治療能夠使其生存率上升至70%以上。采用micro-CT觀察治療終點(diǎn)下各組小鼠的肺部病變情況，結(jié)果顯示，未治療的PF小鼠肺部有大量不均勻的斑片狀陰影，肺邊緣模糊。天然hMSC的治療無(wú)法有效減少PF小鼠肺部的纖維化病灶面積，而其他三組hMSC可以在一定程度上減輕其纖維病變程度，且Pg-Fe-hMSC的減輕程度最為顯著。肺病理切片肺病理切片結(jié)果及相關(guān)纖維化指標(biāo)也體現(xiàn)了Pg-Fe-hMSC的良好治療作用（圖4）。
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圖4.Pg-Fe-hMSC實(shí)現(xiàn)對(duì)已經(jīng)進(jìn)展的小鼠肺纖維化的有效干預(yù)治療。
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考慮到小鼠肺組織與人肺組織的差異性，更好地模擬肺纖維化的疾病過(guò)程，研究者們進(jìn)一步構(gòu)建3D肺細(xì)胞球。隨后，將不同hMSC加入3D肺細(xì)胞球當(dāng)中，可發(fā)現(xiàn)Pg-Fe-hMSC在3D纖維化肺細(xì)胞球模型上表現(xiàn)出最佳的線粒體遞送效率和保護(hù)作用。
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圖5.Pg-Fe-hMSC實(shí)現(xiàn)對(duì)3D纖維化肺細(xì)胞球模型的有效干預(yù)治療。
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最后，通過(guò)RNA測(cè)序手段，研究者們從基因?qū)用骝?yàn)證了，高效和持續(xù)的線粒體靶向遞送可以有效恢復(fù)受損肺細(xì)胞的線粒體功能（圖6）。
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圖6.RNA測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了Pg-Fe-hMSC可以有效恢復(fù)受損肺細(xì)胞的線粒體功能。
吉?jiǎng)P助力
本文GFP過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染試劑盒由吉?jiǎng)P基因提供，助力高水平的科學(xué)研究。
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作者簡(jiǎn)介
浙江大學(xué)藥學(xué)院的高建青教授和張?zhí)碓刺仄秆芯繂T為本文的通訊作者，博士研究生黃婷為本文的第一作者。高建青教授團(tuán)隊(duì)一直致力于基于干細(xì)胞及其衍生物的生物載體靶向遞送系統(tǒng)的構(gòu)建及用于重大疾病的治療研究，近年來(lái)在Nature Communications, Science Advances, Advanced Materials, Advanced Functional Materials, ACS Nano, Journal of Controlled Release, Stem Cells Translational Medicine等期刊持續(xù)發(fā)表了系列研究成果，顯示了干細(xì)胞及干細(xì)胞來(lái)源的外泌體在脊髓損傷、腦卒中、纖維化和腫瘤等疾病治療中的良好應(yīng)用前景，部分成果已推進(jìn)至臨床治療研究。