作者：肖葉寧
肝細胞癌是一種較常見的惡性腫瘤類型，其發病率及死亡率較高，而且早期診斷困難，治療后生存率仍不理想。CCNB2是細胞周期蛋白家族的重要成員之一，是細胞周期進程的正調控分子，能促進多種惡性腫瘤腫瘤發生發展，但在肝癌中生物學功能尚不清楚。本課題組前期研究發現CCNB2和肝癌的發生發展緊密相關，具備成為新型診斷生物標志物和臨床治療靶點的前景，其具體機制仍需進一步解析。2022年3月29日，中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院黃曉曦教授團隊在《Aging-US》上發表題為“Cyclin B2 overexpression promotes tumour growth by regulating jagged 1 in hepatocellular carcinoma”的研究論文，該研究揭示了CCNB2或許經由對JAG1的靶向調節在肝癌發生發展中發揮作用，為進一步研究肝癌發病機理指出了新的思路。CCNB2可能與肝細胞癌的發生發展進程有關，有作為新的治療靶點的潛力。本研究中用于敲低CCNB2的慢病毒產品及用于發現CCNB2下游基因的蛋白質組學、IPA分析均由吉凱基因提供產品或技術服務。
通過轉染慢病毒構建CCNB2敲低的肝癌細胞模型，使用裸鼠荷瘤模型檢驗CCNB2對肝癌的影響。通過TMT蛋白質組學檢測CCNB2下游靶基因，并通過差異蛋白分析、PRM靶向蛋白組學驗證和IPA分析最終篩選出JAG1?；诖?，進一步解析CCNB2通過調控JAG1促進肝癌進展的機制。
研究結果
1. 構建CCNB2低表達的肝癌細胞系
通過轉染慢病毒構建CCNB2低表達的肝癌細胞模型，采用實時熒光定量 PCR評估CCNB2的敲低效率。CCNB2-RNAi慢病毒（由吉凱基因提供）感染后慢病毒感染后的KD組Huh-7細胞中CCNB2基因表達水平明顯下調。
2. CCNB2促進裸鼠腫瘤生長
向隨機分組的20只裸鼠分別皮下注射敲低CCNB2的肝癌細胞系Huh-7和未敲低的肝癌細胞系Huh-7，并觀察裸鼠成瘤情況。裸鼠成瘤實驗結果提示，敲低CCNB2降低裸鼠成瘤率、減小瘤體體積和重量、敲低CCNB2抑制瘤體增殖。總體結果提示，CCNB2可能具有促進肝癌增殖，影響肝癌產生和進展的作用。
3. 蛋白質組學尋找受CCNB2調控的下游基因
進一步，使用敲低CCNB2（KD組，n=3）和未敲低CCNB2（NC組，n=3）的肝癌細胞系Huh-7進行TMT蛋白質組學檢測（由吉凱基因提供）以篩選受CCNB2調控的下游基因。蛋白質組學共檢測到7271個蛋白，其中130個蛋白存在表達差異（fc>1.2，p＜0.05），包含78個上調蛋白和52個下調蛋白。我們從篩選出的差異蛋白質中挑選30個蛋白進行PRM靶向蛋白質組學驗證及IPA分析（均由吉凱基因提供）。結果提示，一個蛋白JAG1在敲低組中下調，且IPA分析顯示JAG1與肝細胞癌增殖和凋亡相關。因此，JAG1作為CCNB2的潛在下游靶點用于后續研究。
4.下調CCNB2可抑制JAG1的表達
我們檢測了裸鼠瘤體中CCNB2與JAG1的表達相關性，結果表明敲低CCNB2可以使JAG1表達下調，CCNB2與JAG1的表達存在明顯的功能相關性。
5. CCNB2通過調控JAG1促進腫瘤細胞增殖和遷移
我們繼續在CCNB2敲低或對照的Huh-7細胞中過表達JAG1，并檢測肝癌細胞增殖能力的改變。結果顯示，敲低CCNB2 降低肝癌細胞系的增殖、遷移和侵襲能力，而過表達JAG1部分回復了CCNB2敲低引起的增殖、遷移和侵襲能力減弱的作用。這一結果印證了CCNB2與JAG1存在明顯的功能相關性，JAG1可能作為CCNB2的下游靶點發揮促進肝細胞癌發生發展的作用。
6. JAG1在肝細胞癌組織中表達上調
本研究收集了82例肝癌石蠟包埋樣本和相對應的20例癌旁石蠟包埋樣本。免疫組化檢測證實了JAG1在肝細胞癌組織中高表達，并且JAG1表達與腫瘤大小、腫瘤數目、癌栓形成顯著有關。
我們的研究驗證了敲低CCNB2在肝癌裸鼠成瘤中的作用，發現敲低CCNB2基因可抑制裸鼠成瘤。CCNB2可能具有促進肝癌增殖作用。通過蛋白質組學、PRM靶向蛋白組學驗證和IPA分析篩選出CCNB2的下游靶標JAG1。細胞功能回復實驗驗證了CCNB2可能通過調控JAG1在HCC發生發展中發揮功能?？傮w，本研究發現了CCNB2的促癌作用，且揭示了一種新的CCNB2下游作用機制。CCNB2在未來可能有機會作為肝癌的候選生物標志物。
吉凱助力
本研究中用于敲低CCNB2的慢病毒產品及用于發現CCNB2下游基因的蛋白質組學、IPA分析均由吉凱基因提供產品或技術服務。
作者簡介
中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院黃曉曦教授為本研究通訊作者，中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院碩士研究生肖葉寧為本研究第一作者。
中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院黃曉曦教授為本研究通訊作者，中南大學湘雅醫學院附屬?？卺t院碩士研究生肖葉寧為本研究第一作者。
左:黃曉曦教授 右:肖葉寧碩士
該研究揭示了CCNB2或許經由對JAG1的靶向調節在肝癌發生發展中發揮作用，為進一步研究肝癌發病機理指出了新的思路。CCNB2可能與肝細胞癌的發生發展進程有關，有作為新的治療靶點的潛力。
吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務領域的技術積累，建立的標準化 、工程化 、系統化的GRP平臺，為中國研究型醫生提供科研服務，加快科研成果轉化。其中，多組學平臺包含蛋白質組學平臺和高通量測序平臺：
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務