背景介紹
Protein L
蛋白L（Protein L）是從大型消化鏈球菌（Peptostreptococcus magnus）中分離得到的一種多結(jié)構(gòu)域細(xì)胞壁蛋白，與抗體的kappa輕鏈的可變區(qū)域相互作用，特別是K1、K3和K4輕鏈，使其能夠與大約67%的人免疫球蛋白和99%的小鼠免疫球蛋白結(jié)合[1]。
Diamond Protein L親和層析介質(zhì)
Diamond Protein L是將Protein L配基同高剛性瓊脂糖基架偶聯(lián)后制成的一種新型親和層析介質(zhì)。相較于常規(guī)介質(zhì)，高剛性瓊脂糖基架流速更快，反壓更低。Protein L配基與抗體kappa輕鏈的可變區(qū)有很強的親和性，所以Diamond Protein L適用于從大批量細(xì)胞培養(yǎng)液中捕獲各種不同大小的抗體片段，如 F(ab')2、Fab、單鏈可變片段（scFv）和半抗。
Fig. 1 抗體IgG和抗體片段示意圖
Diamond Protein L的主要特性
• 高剛性瓊脂糖基架：高流速，可提高生產(chǎn)效率
• 高特異性的kappa輕鏈：可高效捕獲廣泛選擇的抗體和抗體片段
• 高結(jié)合載量：能減少工藝時間和介質(zhì)使用量，降低生產(chǎn)成本
Diamond Protein L技術(shù)參數(shù)
+顆粒大小呈正態(tài)分布，平均顆粒大小是填料體積分布累計的中值粒徑
++線性流速 100cm/h，柱高 10cm，緩沖液條件：20mM PB、0.15M NaCl，pH7.2
+++2%苯甲醇僅用于國外運輸或者客戶指定
實際應(yīng)用案例——半抗親和層析
• 層析填料： Diamond Protein L
• 樣品和上樣量：某半抗，30mg/mL填料
• 平衡緩沖液：20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.2
• 洗脫緩沖液：50mM Gly-HCl，pH2.9
• CIP緩沖液: 15mM NaOH
Fig. 2 Diamond Protein L親和層析圖譜
Fig. 3 Diamond Protein L親和層析純化結(jié)果
使用Tips
緩沖液選擇
• 結(jié)合緩沖液：通常采用中性緩沖液，如：20mM PB，0.15M NaCl，pH7.2
• 洗脫緩沖液：采用低pH緩沖液，如：0.1M檸檬酸鈉 pH2.0~3.5
提高洗脫產(chǎn)品純度
在洗脫步驟可以通過pH線性梯度洗脫，優(yōu)化出合適的洗脫pH范圍。對于具有挑戰(zhàn)性的抗體或抗體片段，純化中通過優(yōu)化洗脫緩沖液濃度，可以進(jìn)一步去除洗脫產(chǎn)品中的聚集體等相關(guān)雜質(zhì)[2]。
在位清洗
如果洗脫產(chǎn)品收率異常，建議在CIP之前先進(jìn)行再生。在用NaOH進(jìn)行CIP之前，建議先用中性pH溶液平衡層析柱，避免低pH下緩沖液與高pH NaOH溶液直接接觸而可能導(dǎo)致的柱內(nèi)溫度升高的問題。
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參考資料
[1] Serene W. Chen, Darryl Tan, et.al (2020) Investigation of the effect of salt additives in Protein L affinity chromatography for the purification of tandem single-chain variable fragment bispecific antibodies, mAbs
[2] Chen Chen, Tetsuya Wakabayashi et.al(2019) Controlled conductivity at low pH in Protein L chromatography enables separation of bispecific and other antibody formats by their binding valency, mAbs