胱天蛋白酶的熒光FMK肽抑制劑被廣泛用于檢測活細胞中的胱天蛋白酶活性，但該技術有一些嚴重的局限性：a）FMK半胱天冬酶抑制劑具有很高的細胞毒性，因為FMK肽與活性胱天蛋白酶共價結合。 b）FMK肽與caspase的不可逆共價結合會抑制caspase活性，導致假陽性凋亡。 C） FMK分析具有極高的背景，并且需要大量洗滌，從而導低的通量。 d）FMK肽在水溶液中不穩定，必須立即使用。 ApoSight Green Caspase 3/7底物可以用96孔或384孔板進行實驗，并易于適應自動化。下面我們一起來了解該產品的實驗方案及實驗過程吧。
適用儀器
流式細胞儀
Ex:??????????????????488 nm 激發
Em:?????????????????530/30 nm 濾波片
通道： ??????????????FITC通道
熒光顯微鏡
Ex:??????????????????FITC濾波片組
Em:?????????????????FITC濾波片組
推薦板孔： ?????????黑色透明底板
實驗方案
樣品實驗方案
簡要概述
1.使用96孔板的密度為5×104至2×105細胞/ 100 μL /孔的待測化合物制備細胞
2.加入等體積的ApoSight Caspase 3/7底物工作溶液
3.在5％CO2培養箱中于37°C孵育60分鐘
4.用HHBS洗滌細胞1-2次
5.使用帶有530/30 nm濾波片（FITC通道）的流式細胞儀或帶有FITC濾波片組的熒光顯微鏡分析細胞
溶液配制
1.儲備溶液配制
所有未使用的儲備溶液應分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。 避免重復凍融循環。
ApoSight Green Caspase 3/7底物儲備液（200X）
在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復的凍融循環。
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2.工作溶液配置
ApoSight Green Caspase 3/7底物工作溶液
在ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物瓶中加入50 μL DMSO，制成200X ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物原液。
注意，一次性使用等分試樣，以避免重復的凍融循環。
樣品示例及操作
懸浮培養中誘導細胞凋亡的實例
1.用2μg/ mL喜樹堿處理Jurkat細胞3小時
2.用1μM星形孢菌素處理Jurkat細胞3-4小時
3.用4μg/ mL喜樹堿處理HL-60細胞4小時
4.用1μM星形孢菌素處理HL-60細胞4小時。
注意，應對每個細胞系進行單獨評估，以確定誘導凋亡的佳細胞密度。
熒光顯微鏡的樣品方案
1.用5×104至2×105個細胞/ 100 μL /孔/ 96孔板的密度制備含待測化合物的細胞。
2.向細胞中加入等體積的Caspase 3/7底物工作溶液（100 μL /孔/ 96孔板）。
3.在5％CO2培養箱中于37°C孵育60分鐘。
4.用HHBS或您選擇的緩沖液洗滌細胞1-2次。
5.使用FITC濾波片組的熒光顯微鏡成像。
流式細胞術的樣品方案
1.以1：200的比例將200 X ApoSight Green Caspase 3/7底物原液添加到細胞溶液中，并在5％CO2培養箱中于37°C孵育細胞60分鐘。
注意，用于ApoSight Green Caspase 3/7底物標記的細胞可濃縮至約5 X 106細胞/ mL。適當的孵育時間取決于所用的單個細胞類型和細胞濃度。
2.使用530/30 nm濾波片（FITC通道），通過流式細胞儀檢測熒光強度。
注意，要增加信號/背景比，請以約200 g的速度旋轉細胞5分鐘，用1 mL洗滌緩沖液（例如HHBS或所選緩沖液）洗滌細胞，然后將細胞重懸至所需的洗滌量。
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圖示
圖1.使用ApoSight 綠色胱天蛋白酶3/7底物檢測Jurkat細胞中胱天蛋白酶3/7活性。將Jurkat細胞（200,000個細胞/孔/ 96孔板）用1μM星形孢菌素或DMSO處理4小時。將細胞與Caspase 3/7底物工作溶液在37°C下孵育1小時。使用FITC濾波片組，用熒光顯微鏡拍攝圖像。
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