結直腸癌（CRC）是全球第四大致命癌癥，每年有近90萬人死亡。盡管治療取得了越來越多的進展，但癌癥相關死亡中結直腸癌的死亡率，特別是轉移性結直腸癌的死亡率仍然很高。
此前TCGA和CPTAC結直腸隊列中的研究揭示了結直腸癌的多組學特征和分子異質性。然而，這些研究更多地關注非亞洲人群中的非轉移狀態。因此中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（上海生物化學與細胞生物學研究所）曾嶸研究員、吳家睿研究員與海軍軍醫大學第一附屬醫院（上海長海醫院）張衛教授對中國人群的轉移性CRC開展了相關研究，研究成果以題為“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”發表在Cancer Cell雜志上。該研究工作整合系統生物學理論，采用了大量的組學分析技術，對轉移性結直腸癌（mCRC）基因組學、蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學進行全面整合，揭示了不同亞型和轉移的蛋白質組和磷酸化蛋白組特征。同時，利用蛋白-磷酸化關系對潛在腫瘤靶向藥物進行評估，為CRCs的靶點和治療評估研究提供了指導。
樣本：146例患者，其中包括70名轉移性CRC（mCRC）患者和76名早期非轉移性CRC患者。從每位患者獲取原發性腫瘤組織（T），遠端正常組織（N），癌旁組織（P，正常鄰近組織）和匹配的外周血細胞（BC）。其中針對mCRC還取樣了遠處肝轉移組織（LM）。最終330例樣本進行了全外顯子測序，480例樣本進行了DIA蛋白質組和DIA磷酸化蛋白質組分析。
組學技術：基因組學（全外顯子測序、DNA甲基化芯片）、DIA蛋白質組學、DIA磷酸化蛋白質組學。
研究結果
1、中國CRC的突變特征
在146名CRC患者的原發性腫瘤中鑒定出107個非同義，體細胞，單核苷酸變體和7個插入或缺失，與TCGA CRC隊列獲得的結果相似。與以前的研究一致，CCRC隊列中最常觀察到的與癌癥相關的突變是APC（65%突變頻率），TP53（64%）和KRAS（32%）。CCRC隊列與TCGA和MSK CRC隊列的臨床病理學特征存在差異，含有更高比例的轉移性結直腸癌和直腸癌病例。與這兩個隊列相比，CCRC中的APC、TP53、BRAF和PTEN突變的頻率明顯更低，PRRC2A，PPFIA4，CPD和NURP1L基因的突變頻率更高。
通過比較CCRC隊列的非mCRC和mCRC中基因組改變的頻率，研究團隊發現：（1）與非CRC相比，mCRC原發腫瘤的突變負擔降低。（2）在CRC中最常見的突變基因中只有SMAD4在mCRC患者的原發腫瘤中顯示出顯著更高的突變率；XIRP2在mCRC患者的原發性腫瘤中也顯著高度富集。（3）SBS 1對mCRC的貢獻率顯著高于對非mCRC的貢獻率，且先前已被報道為結腸癌和乳腺癌的轉移特征。（4）mCRC患者的原發性腫瘤表現出更多的多克隆結構。
2、基于蛋白質組學數據的亞型分類
對原發腫瘤和遠端正常組織之間的2440個差異表達蛋白質進行了共識聚類，將146個CCRC原發性腫瘤分為3個亞型：
1. CC1的特征是增加了RNA加工和DNA錯配修復（MMR）。
2. CC2中上調的蛋白質富集細胞外基質（ECM）-受體整合，粘著斑和免疫相關途徑。
3. CC3具有豐富的DNA復制和代謝途徑上調功能。
三種亞型具有不同的無復發生存能力，與CC1和CC2亞型的mCRC患者相比，CC3中的mCRC患者表現出最差的無復發生存概率。非mCRC患者在三種亞型之間的無復發生存率沒有顯著差異。
3、磷酸化蛋白質組學譜將mCRC與非mCRC區分開
蛋白質組分型未將mCRC與非mCRC患者區分開。通過共識聚類發現，磷酸化蛋白組數據能將原發腫瘤與mCRC和非mCRC區分開來,劃分出6種磷酸化蛋白質組亞型。SC1，SC3和SC5富含mCRC，而SC2，SC4和SC6是非mCRC的特征。功能富集分析發現SC1，SC3和SC5中高表達的磷酸化蛋白質富集在粘著斑和粘附連接途徑。在SC2，SC4和SC6中上調的磷酸化蛋白質在ERBB2信號通路，子宮內膜癌，抗原加工和呈遞以及FcγR介導的吞噬作用途徑中富集。
4、轉移性結直腸癌的蛋白質組學特征
對于mCRC，在原發性和轉移性腫瘤中觀察到突變譜之間的高度一致性。最頻繁突變的SCNA在原發性和轉移性腫瘤之間沒有顯示出差異，而轉移性mCRC腫瘤與原發性腫瘤相比表現出更大的單克隆比例?？傊?，這些結果表明轉移性腫瘤來自原發性腫瘤或來自相同的祖先克隆。蛋白質組學分析顯示轉移性腫瘤與原發性腫瘤明顯不同，轉移性腫瘤與正常組織相比具有更多的上調蛋白。這些差異表達的蛋白質清楚地區分了原發組織的轉移組織。在每種亞型中，與正常組織表達不同的蛋白質在原發性和轉移性組織之間也是不同的。
5、mCRC患者四種組織中的磷酸化位點與蛋白質的共變異關系
選取42名mCRC患者四種組織類型（N、P、T、LM），計算四種組織的磷酸位點豐度與蛋白質豐度之間的相關系數。結果表明，在所有CC亞型中，相關性均呈雙峰分布，并明顯向正值偏移。為了尋找三種CC亞型之間顯著共調節的磷酸化位點與蛋白質的關系，使用ANOVA成功鑒定了三種CC亞型之間顯著不同的954對磷酸位點-蛋白成對關系。CC2明顯表現出更多的負調控相互作用，而CC3和CC1表現出更多的正相關。954對磷酸位點-蛋白質分為三個簇：CC1陰性（CC1neg），CC2陰性（CC2neg）或CC3陰性（CC3neg）。研究小組進一步將實驗驗證的或預測的激酶-底物對映射為CC1neg、CC2neg和CC3neg簇成員。利用超幾何分布，為每個聚類選擇了富集的激酶。通過進一步的實驗結合通路富集分析的結果發現，激酶的磷酸化-蛋白共變異可能來自基因組變異，患者多種組織中磷酸化位點-蛋白的關系顯示出與蛋白質組亞型相關的明顯特征。
6、磷酸化蛋白質組學分析為mCRC提供可藥物靶標
考慮到蛋白激酶已被開發為癌癥治療的可行藥物靶點。通過進行激酶底物富集分析，研究發現不同CC亞型富含不同的激酶，同一CC亞型中的原發性和轉移性組織對同一激酶顯示出不同的活性。對于具有可定量蛋白質水平和臨床可行藥物的激酶，通過分析mCRC的42對N-T或N-LM組織中相應的磷酸化底物豐度，觀察到mCRC患者的不同組織和蛋白質組學亞型中磷酸化底物和激酶的高度異質性?；诩っ?磷酸化底物之間的Pearson相關系數，構建了每種蛋白質組亞型中原發性和轉移性腫瘤的激酶底物網絡。在每種蛋白質組亞型中，原發性腫瘤和轉移瘤之間的激酶-磷酸化底物網絡存在顯著差異，并且CC3網絡與CC1的相似性大于與CC2的相似性。亞組內原發性和轉移性腫瘤之間的激酶-磷酸底物網絡的差異也大于亞型間原發性腫瘤的差異。這些觀察結果表明在臨床治療中對相應抑制劑的個性化和定位特異性反應。
為了進一步探索mCRC患者藥物反應的可能性，我們對31種miniPDX模型進行了三種激酶抑制劑（阿法替尼，吉非替尼和瑞格非尼）的藥理學測試，包括9對原發轉移性腫瘤和13種其他原發性腫瘤。通過腫瘤細胞生長抑制測量每種腫瘤對每種藥物的藥物反應效應，并確定來自同一個體的原發性和轉移性腫瘤可能對相同藥物表現出不同的反應。在指示治療的適宜性方面，研究表明磷酸化蛋白質組讀數可能比突變的存在更敏感?；诩っ?磷酸底物網絡與藥物敏感性之間的相關性。研究小組構建了基于1696個邊緣強度特征的彈性回歸模型，用于預測藥物反應。結果表明，激酶-磷酸底物網絡在預測mCRC患者的藥物敏感性方面具有強大的潛力。
研究結論
本研究通過對轉移性癌癥的大規模組學研究表明蛋白質組學模式可以明確分類CRC患者的原發性腫瘤，并具有區分潛在預后結果的能力。轉移和非轉移CRC患者之間，原發性腫瘤的突變特征幾乎沒有差異。然而，組合蛋白質組學和磷酸化蛋白質組學分析在區分轉移性和非轉移性患者方面提供了最高的準確性。激酶-磷酸化底物分析網絡分析可以準確反映藥物反應，這為未來腫瘤藥物的研究與開發提供了新的思路和方向。
蛋白質組技術推薦建議
此次分享的文獻采用的是DIA蛋白質組學和DIA磷酸化蛋白質組學技術。事實上，蛋白質組學技術存在不同技術路線，以磷酸化蛋白質組為例，每種技術有其技術優勢，可根據樣本數量以及對數據質量的要求進行綜合選擇，例如樣本數≥30例，就可以考慮用4D-DIA磷酸化蛋白質組技術。各類技術特點如下：
| 項目 | TMT磷酸化 | 4D Label free磷酸化 | 4D-DIA磷酸化 |
| 樣本數量建議 | ≤16例 | ≤30例 | ≥30例 |
| 是否標記 | 標記 | 非標記 | 非標記 |
| 數據采集模式 | DDA | DDA | DIA（備注：建庫用DDA) |
| 儀器 | 賽默飛Orbitrap系列儀器 | 布魯克timsTOF Pro或Pro2 | 布魯克timsTOF Pro或Pro2 |
| 細胞、組織檢測能力* | 7000-30000（近2年項目，95%以上項目平均15000+） | 18000~40000 | |
| 技術特點 | 經典技術，混樣檢測，平行性好，缺失值極少，但一次實驗樣本數受標記試劑限制 | 一例例檢測，實驗設計靈活，位點鑒定準，但樣本量大的時候，缺失值嚴重 | 一例例檢測，大樣本優選技術，缺失值少，位點鑒定準，定量更準 |
吉凱基因憑借多年在靶標篩選及驗證服務領域的技術積累，建立的標準化 、工程化 、系統化的GRP平臺，為中國研究型醫生提供科研服務，加快科研成果轉化。其中，多組學平臺包含蛋白質組學平臺和高通量測序平臺：
·蛋白質組學平臺擁有多臺timsTOF Pro、Exploris 480高精度質譜儀，專業的Spectronaut Plusar、Mascot等分析軟件，提供專業的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修飾組、olink蛋白質組等檢測服務，強大的機器學習算法、IPA分析、蛋白基因組分析服務，系統的生物標志物、分子分型、藥物靶點、基因功能研究等解決方案，真正讓廣大研究型醫生的科研工作更省心、更省力、更高效；
·高通量測序平臺分為常規測序服務和單細胞測序服務：單細胞測序擁有10x和BD兩個平臺，提供單細胞RNA-seq、單細胞核測序、單細胞混樣RNA-seq、單細胞TCR/BCR、單細胞（RNA+ATAC）、空間轉錄組測序等服務；常規測序服務提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修飾測序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙?；揎棞y序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻譯組測序） 、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全轉錄組測序（兩文庫/三文庫）、外泌體miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服務。