水質(zhì)對 HPLC、LC-MS 影響

M.Turan and S.Mabic

摘要：優(yōu)化的高效液相色譜法分析需要高純度溶劑和試劑。水質(zhì)是非常重要的，它不僅是高效液相色譜法的一種溶劑，同時在樣品配置，標(biāo)液和空白對照中起作用。大量實驗表明，中痕量有機(jī)物的水(用于流動相)存在可能影響高效液相色譜實驗結(jié)果。特別是在進(jìn)行痕量級別的分析時，有機(jī)物可能會導(dǎo)致雜峰出現(xiàn)，基線漂移。柱效可能會阻塞，導(dǎo)致分辨率降低，峰拖尾。水中的有機(jī)物可能極大地影響液相色譜-質(zhì)譜分析的結(jié)果。有機(jī)污染物易電離，就會與分析物結(jié)合，從而影響實驗結(jié)果。

本文主要研究在常規(guī)的高效液相色譜法分析下，使用新鮮制取的低總有機(jī)碳 (TOC)超純水的好處。低的總有機(jī)碳通過 UV 光氧化技術(shù)來實現(xiàn)從而達(dá)到含量小于 5 ppb 的TOC級別。高效液相色譜級瓶裝水和低 TOC 新鮮制取的超純水作為弱溶劑梯度洗脫，用乙*作為強(qiáng)溶劑，分離七種藥劑混合物。重復(fù)多次實驗，進(jìn)行初始和最終色譜性能比較。結(jié)果表明，隨著時間的推移，使用新鮮制取的低總有機(jī)碳 (TOC)超純水仍能很好的被色譜柱分離。通過 LC-MS 檢測不同 TOC 水平的水質(zhì)處理的預(yù)濃縮水樣表現(xiàn)出來的效果不一樣。預(yù)濃縮的水被分析柱洗脫，紫外處理和質(zhì)譜的數(shù)據(jù)顯示使用新鮮制取的低總有機(jī)碳 (TOC)的超純水能獲得更好的基線。

實驗方法:

藥劑的混合

以下按照色譜藥品標(biāo)準(zhǔn)來自 Alltech 濃度 1 毫克/毫升

在甲醇溶解: 對乙酰氨基酚、 乙酰唑胺、卡馬西平、苯巴比妥、苯妥英、萘丁美酮和速可。混合物制備每種藥品含 0.200 μ g/m l 。

流動相

水和乙*作為流動相。水有兩個來源: HPLC 級瓶裝水(Fisher) 和 Milli-Q Gradient A10 (Millipore)并通過

0.22 微米的 Millipak ?所制造的新鮮水。乙*是高效液相色譜級(Fisher)。

儀器：高效液相色譜系統(tǒng): Waters 510 HPLC 色譜泵；717 加自動進(jìn)樣器；9966 光電二極管陣列，設(shè)置在

190-400 毫微米的探測器；列: SymmetryShield RP18 (Waters), 3.5 μ m，4.6 x 150 毫米。程序：25 μ L 注射藥物混合通過 0.45 μ m 13 毫米 Millex ?-LCR 過濾裝置過濾。按照以下的梯度洗脫 (水: 乙*)

組分的混合物的分離:

80%至 30%水的 15分鐘

30%至 80%水 1 分鐘，再進(jìn)行 80%水 4 分鐘兩種不同類型的水作為流動相

純化鏈:

結(jié)果和討論:

圖 1：在 214 nm，流動相分別為(A) 高效液相色譜級水、 (B) 與 TOC< 5 ppb 超純水圖譜 1-對乙酰氨基酚、 2-乙酰唑胺、 3-苯巴比妥、 4-卡馬西平，5-苯妥英、 6-速可，7-萘丁美酮

圖 2：在 254 nm，流動相分別為(A) 高效液相色譜級水、 (B) 與 TOC< 5 ppb 超純水圖譜。請注意在圖譜 A 顯示的雜峰

圖 3：使用相同藥物混合物在重復(fù)注射 780 次后峰面積變化。

圖 4：(A) 水有無紫外燈氧化的圖譜對比。(B) 無紫外燈氧化水在 13.1 分鐘質(zhì)譜圖譜 (TOC = 12 ppb)。(C) 紫外燈處理的水(TOC = 4 ppb)在 13.1 分鐘質(zhì)譜圖譜。

高效液相色譜法通常建議使用 HPLC 級瓶裝水為流動相的制備。這種類型的水被證明有低紫外線吸收度和能釋放離子。因此，這種規(guī)格的水含有一定的有機(jī)雜質(zhì)。這種雜質(zhì)會影響高效液相色譜法分析，尤其是在梯度洗脫。有機(jī)雜質(zhì)將色譜填料結(jié)合，色譜被洗脫最終出現(xiàn)雜峰。這就會給色譜分離帶來困難或錯誤。此外，這些雜質(zhì)會導(dǎo)致基線升高，降低靈敏度。采用雙波長 [185 + 254 nm] UV 燈能生成羥基自由基(OH) (方案 A)氧化有機(jī)分子，有效降低 TOC 到低 ppb 水平 (通常 < 5ppb)。最終產(chǎn)物有機(jī)酸是經(jīng)過紫外燈再由混合離子交換樹脂接留下來的。

此次研究，將高效液相色譜級瓶裝水和 TOC <5 ppb 新鮮制取的超純水作為洗脫劑對 7 種藥物混合物(數(shù)字 1-3) 高效液相色譜法分離比較。混合物被反復(fù)注射，對第 50 和 1310 次 注射圖譜進(jìn)行了比較。圖1和圖2分別 是 214nm 和 254nm 圖譜，顯然，在進(jìn)行1260次重復(fù)實驗后，使用低TOC 新鮮制取的超純水比高效液相色譜級瓶裝水基線更穩(wěn)定。在同樣的重復(fù)注射后，高效液相色譜級瓶裝水顯示基線往正方向漂移。在圖2A，在重復(fù)注射第 1310 次的 HPLC 級瓶裝水約 5 分鐘后出現(xiàn)雜峰。這可能是由于有機(jī)物污染物結(jié)合到色譜填料上被洗脫下來。圖 2B 使用了超純水并沒有出現(xiàn)雜峰。圖3對比之間第 50 和1310 次注射色譜峰的峰面積的變化。當(dāng)采用超純水，峰面積的變化較少。圖4LC-MS 數(shù)據(jù)表明紫外燈氧化能降低純水中的有機(jī)污染物。185/254nm UV燈被關(guān)閉時，會出現(xiàn)若干雜峰 (圖 4A，藍(lán)色標(biāo)記)。圖 4B 顯示在 13.1分鐘出現(xiàn)的峰值最大。圖 4B顯示在13.1分鐘峰的質(zhì)譜圖，m/z 279是峰值最高的。當(dāng)UV 燈打開后，這個峰值顯著降低。 (圖 4A 中的粉紅色標(biāo)記，質(zhì)譜在圖4)。

結(jié)論:

• TOC <5ppb 新鮮制取的超純水作為流動相進(jìn)行 HPLC 分析能避免雜峰的出現(xiàn)，有助于明確識別的峰外觀，更重要的是在定量分析研究中是必不可少的。
• 使用這種高質(zhì)量水的基線漂移最小化。
• 通過 UV 燈氧化處理得到低 TOC 超純水可以獲得高效率的前處理系統(tǒng)。

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